Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase

Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến được phát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biến đồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểu gen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%, đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 - 5,6%.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Áp dụng kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylaseTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCÁP DỤNG KỸ THUẬT MLPA TRONG PHÁT HIỆNĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2 GÂY BỆNH TĂNG SẢNTHƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21-HYDROXYLASETrần Vân Khánh1, Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Lương Hoàng Long1,Lê Thị Phương1, Ngô Thị Thu Hương1, Tạ Thành Văn11Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ươngTăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thểthường gây nên do đột biến gen CYP21A2 trong đó đột biến xóa đoạn được phát hiện chiếm tỉ lệ 20 - 25%.Kỹ thuật MLPA là kỹ thuật thường được áp dụng với hiệu quả và độ chính xác cao. Kỹ thuật MLPA được ápdụng để xác định đột biến xóa đoạn trên 102 bệnh nhân. Kết quả cho thấy 35/102 (34,3%) bệnh nhân có độtbiến xóa đoạn gen CYP21A2. Trong số các bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, 85,7% đột biến đượcphát hiện ở bệnh nhân thể mất muối, 14,3% được phát hiện ở bệnh nhân thể nam hóa đơn thuần. Đột biếnđồng hợp tử chiếm 57,2%, đột biến dị hợp tử chiếm 42,8%. Nghiên cứu đã phát hiện được 9 kiểu gen, kiểugen có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là dị hợp tử xóa đoạn Del/– với 34,1%, tiếp đến là kiểu gen Del/Del với 28,6%,đột biến đồng hợp tử xóa đoạn exon 1 - 3 chiếm tỉ lệ là 14,3%, các dạng đột biến còn lại chiếm tỉ lệ từ 2,9 5,6%.Từ khóa: Tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn, gen CYP21A2, MLPAI. ĐẶT VẤN ĐỀđột biến điểm chiếm 70 - 75% [5]. Tùy từngTăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếudạng đột biến gen CYP21A2, các kỹ thuật21-Hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễmkhác nhau sẽ được sử dụng để xác định độtsắc thể thường, do khiếm khuyết một phầnbiến. Kỹ thuật Southern blotting, PCR vàhoặc hoàn toàn của một trong số các enzymMLPA thường được dùng để xác định đột biếntham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ởxóa đoạn gen [6]. Những bệnh nhân khôngtuyến thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàngxác định được đột biến xóa đoạn sẽ được tiếnlà cơn suy thượng thận cấp hoặc nam hóa ởhành giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2 đểtrẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai [1; 2]. Cácxác định đột biến điểm [7].nghiên cứu đã cho thấy 95% ca mắc tăng sảnKỹ thuật đầu tiên được ứng dụng để xácthượng thận bẩm sinh có nguyên nhân do độtđịnh đột biến xóa đoạn là Southern blotting,tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm là thờibiến gen CYP21A2, là gen quy định tổng hợpcho enzym 21-Hydroxylase [3; 4]. Cho đếnnay, nhiều dạng đột biến đã được phát hiệntrong đó đột biến xóa đoạn chiếm 20 - 25%,Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứuGen-Protein, Trường Đại học Y Hà NộiEmail: tranvankhanh@hmu.edu.vnNgày nhận: 14/8/2018Ngày được chấp thuận: 22/10/2018TCNCYH 117 (1) - 2019gian thực hiện lâu và cần sử dụng phóng xạ.Hiện nay, phương pháp thường được sửdụng để xác định đột biến xóa đoạn là MLPA,phương pháp này đảm bảo được độ chínhxác cao, thời gian thực hiện nhanh và có thểxác định được toàn bộ các dạng đột biến xóađoạn gen [8]. Nghiên cứu được thực hiện vớimục tiêu: Xác định đột biến xóa đoạn genCYP21A2 trên bệnh tăng sản thượng thận1TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCbẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylasebằng kỹ thuật MLPA.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứuThời gian: từ tháng 1/2014 đến thángII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP1/2016.Địa điểm: Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di1. Đối tượngtruyền, Bệnh viện Nhi Trung ương và Trung102 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩmsinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase đượcchẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trungương.tâm nghiên cứu Gene - Protein, Trường Đạihọc Y Hà Nội.2. Phương pháp2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân- Trẻ gái: có nam hóa được phát hiện khisinh hoặc nam hóa sau sinh, tăng trưởng sớmchiều cao và tuổi xương.- Trẻ trai: dậy thì sớm giả, tăng sớm chiềucao và tuổi xương.DNA được tách chiết từ bạch cầu máungoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tấtcả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồngđộ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và đượcsử dụng để phân tích.2.2. Kỹ thuật MLPA- Cả hai giới: có biểu hiện mất muối nhữngtuần đầu sau sinh: mất nước, hạ natri và clo,Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnhtăng kali huyết thanh.nhân và người lành mang gen bệnh. Thành- Tăng 17-OHP huyết thanh vào lúc sángsớm:Trẻ sơ sinh ≥ 1 ng/ml (bình thường < 1 ng/ml).phần của kit gồm các đầu dò (probe) đểkhuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tươngứng với một vùng gen, ngoài ra còn có cácđầu dò đặc trưng cho gen của người cũngSau tuổi sơ sinh: ≥ 2 ng/ml.được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dòcho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới1.2. Tiêu chuẩn loại trừtính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di- Loại trừ các thể tăng sản thượng thậnbẩm sinh khác (được khẳng định bằng chẩnđoán phân tử) bao gồm thiếu 11 βhydroxylase;thiếu3β-hydroxysteroiddehydrogenase typ 2.- Loại trừ các bệnh nhân suy thượng thậnbẩm sinh do các nguyên nhân khác như giảmsản thượng thận bẩm sinh, suy thượng thậnmao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sảnphẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệthuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặchiệu với đầu dò đó.Quy trình MLPA: Cho 5µl DNA cần phântích vào 1 ống PCR, biến tính ở 98oC trong 5phút. Nhiệt độ được chuyển về 2oC trước khicho 3µl hỗn hợp chứa các đoạn oligonucleotidcủa các probe. Hỗn hợp được ủ ở 60oC trongbẩm sinh do suy yên.- Loại trừ các bệnh nhân nam dậy thì sớm16 giờ, lúc này 2 đoạn lai của 2 phân tửgiả và bệnh nhân nữ nam hóa do các nguyênoligonucleotid sẽ gắn với exon đích đặc hiệu ởnhân khác như u vỏ thượng thận nam hóa.vị trí sát nhau. Thêm 32µl hỗn hợp ligase2TCNCYH 117 (1) - 2019TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCbuffer, ủ ở 54oC trong 15 phút, lúc này enzymexon đột ...