Bài giảng Đạo đức 3 bài 1: Kính yêu bác Hồ

Giới thiệu đến quý bạn đọc bộ sưu tập với nhiều bài giảng: Kính yêu bác Hồ được tổng hợp và biên soạn bởi nhiều giáo viên khác nhau.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Đạo đức 3 bài 1: Kính yêu bác Hồ2.1. Phân tích acid nucleic: b. Phân tích ADN nhiễm sắcthể: Phương pháp phân tích ở đâybao gồm việc tách ADN của nhiễmsắc thể và cắt bằng enzym cắt hạnchế để phân biệt giữa các vi sinhvật với nhau. Một chú ý khi táchADN nhiễm sắc thể phải thao tácnhẹ nhàng để tránh đứt gãy donguyên nhân cơ học. Nói chung cácmảnh cắt nên có kích thước nhỏhơn hoặc bằng 50 kb. Việc tách cácmảnh cắt đó được thực hiện dựavào kỹ thuật điện di trong trườngxung điện(PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis ).style=text-align: justify;margin-top: 6.0pt> Như vậykỹ thuật dấu vân tay không chỉ ápdụng trong trường hợp trên tế bàomang plasmid mà kỹ thuật này cònđược sử dụng với nhiễm sắc thểcho mọi trường hợp.rườnghợp.ường hợp.ường hợp. Liên quan đến vấn đề nàyphải kể đến kỹ thuật BRENDA:phân tích kết quả xử lý enzym cắthạn chế với vi sinh vật. Ở đây cáchchọn loại enzym cắt hạn chế vôcùng quan trọng, theo cách chọnnày có thể tạo ra quá nhiều mảnhcắt nên không thể phân biệt đượccác băng riêng rẽ trong khi đó đốivới các trường hợp khác lại tạo raquá ít mảnh cắt có kích thước lớnkhó tách theo các kỹ thuật điện dihiện có. Các vi sinh vật khác nhaucó tỷ lệ GC khác nhau (dao động từ25-75%) các mảnh cắt thu được saukhi xử lý enzym cắt hạn chế rấtkhác nhau. Theo Nei M. và Li W.H. (1979) thì số mảnh cắt có thểthu được tính trên lý thuyết là:a = (g/2)r1 x {1-(g/2)}r2 Trong đó: g - tỷ lệ GC củaADN r1 - số cặpGC r2 - số cặpAT trong vị trí cắt của enzym giớihạn sử dụng a - số vị trícắt khi sử dụng enzym cắt hạn chế. Mặt khác, người ta cũng căn cứvào kết quả nghiên cứu các vị trícắt của bộ gene vi sinh vật làm cơsở cho cách chọn enzym cắt. Thôngthường cho mỗi phép phân tíchngười ta ghi được số các băng cắtbởi enzym và tính toán kích thướccác mảnh tạo thành làm cơ sở chocác phép phân tích về sau. Tuynhiên, một trong những nguyênnhân hạn chế cho phép phân tíchtrên là các phương pháp tách ADNthông thường đều dẫn đến thay đổikích thước do đứt gãy ADN nhiễmsắc thể, mặt khác sự có mặt củaplasmid lẫn cũng tạo ra sự khác biệtgiả trong kết quả phân tích, để khắcphục nhược điểm trên người ta phảithực hiện phép phân tích ADNnhiễm sắc thể nguyên vẹn để pháthiện các nguồn ADN tạp nhiễm lẫnvào kết quả phân tích. + Kỹ thuật điện di trongtrường xung điện (điện di trongtrường điện thay đổi, PFGE) - Nguyên tắc: Trước tiên cácmẫu đưa vào phân tích phải đượcxử lý trước bằng loại enzym cắthạn chế mà có rất ít điểm cắt. Kếtquả phải tạo ra được các mảnh cókích thước lớn (50 kb – 12 Mb),với kích thước này không thể điệndi theo phương pháp thông thườngmà chỉ có thể tách ra bằng kỹ thuậtPFGE (ật PFGE (ật PFGE (uậtPFGE (Pulsed-Field GelElectrophoresis ). Kỹ thuật PFGElần đầu tiên được Schwartz vaCantor (1984) giới thiệu. Tuy nhiênsau đó đã có nhiều tác giả mô tả lạikỹ thuật này, tuy có sai khác ítnhiều nhưng cơ sở lý thuyết củacác phương pháp này là như nhau:Mục đích của kỹ thuật này là tăngkhả năng di động của các mảnhADN có kích thước lớn trong điệntrường, do đó các thành phần gel vàđệm hầu như không thay đổi theocác phương pháp điện di thôngthường. Tuy nhiên theo phươngpháp thông thường thì sự điện diliên quan đến sự di động của cácmảnh ADN có kích thước khácnhau trên gel agarose trong mộttrường điện không đổi. Kết quả ởđây là phân tử lớn khó di động hơnphân tử nhỏ qua mắt xích agarose,tạo ra sự tách biệt trong trường điệndi. Trong trường hợp PFGE lực làmthay đổi khả năng di động lại làtrường điện tích thay đổi liên tụcdẫn đến các mảnh ADN có kíchthước khác nhau thay đổi hướng diđộng. Như vậy kết quả là các mảnhcó kích thước khác nhau sẽ có khảnăng di động khác nhau. Kíchthước càng lớn thì mức độ di độngcàng chậm. Sự di động khác nhaucủa ADN chủ yếu phụ thuộc vàokích thước chứ không phải do gelagarose như ở phương pháp điện dithông thường, hình 1.2.Hình 1.2. Sử dụng kỹ thuật PFGEphân tích nhiễm sắc thểsau khi xử lý với Sma I với 7 chủngHaemophilus ìnluenzae. Tiếp theo các mô tả củaSchwartz va Cantor, Smith vàCodemine (1990) đã đề cập đến sựdi chuyển của các mảnh ADN khácnhau là hàm số tuyến tính với kíchthước của chúng. Trên cơ sở đó cóthể điều chỉnh các xung điện vàđiện trường. Tuy nhiên các nhân tốkhác cũng có mối tương tác lẫnnhau và ảnh hưởng đến khả năng diđộng của ADN như: nhiệt độ, điệnthế, nồng độ agarose cũng nhưnồng độ ion trong đệm. - Chuẩn bị ADN cho PFGE:Chuẩn bị ADN từ nhiễm sắc thểkhông giống như các phương phápchuẩn bị ADN plasmid. Một vấn đềthường xảy ra là sự đứt gãy ngẫunhiên ADN dẫn đến sai khác trongkết quả phân tích. Để hạn chế điềunày người ta phải thực hiện kỹthuật tách ADN NST khỏi tế bàomẫu agarose có nhiệt độ nóng chảythấp – LMT (Schwartz va Cantor –1984 và Smith, Klco 1988). Theophương pháp này hỗ ...