Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 - Bùi Hồng Quân

Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 Các phương pháp phân tích DNA, cung cấp cho người học những kiến thức như: Chiết tách DNA; Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic; Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng; Các phương pháp xác định trình tự DNA; Kỹ thuật PCR. Mời các bạn cùng tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Sinh học phân tử: Chương 10 - Bùi Hồng Quân Chương 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNAhttp://buihongquan.com Các phương pháp phân tích DNA • Chiết tách DNA • Các phương pháp định tính và định lượng sơ bộ acid nucleic • Kỹ thuật cắt, nối, lai DNA và ứng dụng • Các phương pháp xác định trình tự DNA • Kỹ thuật PCRhttp://buihongquan.com Chiết tách vật liệu di truyền • Nguyên tắc chung: 3 bước – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học – Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform – Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối • Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước – ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid – Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền – Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy – ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase – Tủa lượng ADN nhỏ: độn bằng tARN – Tủa bằng isopropanol, tert-butanol,… • Các kỹ thuật khác – Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB – Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụhttp://buihongquan.com • Tinh chế acid Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn nucleic – Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride (CsCl) – Gradient saccharose • Sắc ký – Sắc ký ái lực: sử dụng pha tĩnh là U-Sepharose hay oligodT- cellulose để tinh chế mARN. – Sắc ký lọc gel để tách các nucleotid tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu. – Sắc ký trao đổi ion trên vi cột, áp dụng để thu hồi những lượng ADN rất nhỏ. – Sắc ký lỏng hiệu năng cao: dùng để tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải là 1 nucleotid), plasmid, phân tách các đoạn ADN. • Điện di: – Agarose – PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)http://buihongquan.com Định tính - định lượng acid nucleic • Quang phổ kế: OD260nm – 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi – 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn – 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) – Kiểm tra độ tinh khiết bằng tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280, OD320nm • Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong gel – Định tính theo kích thước – Định lượng bằng so sánh với chuẩnhttp://buihongquan.com Điện dihttp://buihongquan.com Các enzym biến đổi acid nucleic • Enzym cắt hạn chế / methylase – Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù – Lưu ý tính tương thích khi cắt nối • Polymerase – ADN polymerase phụ thuộc ADN – Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) – ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu – ARN polymerase phụ thuộc ADN • Ligase – Nối hai đoạn ADN C-A-T-G-A-T A-T-G-A-T-G C-A-T-G-A T-G-T-G-A-T-G C-A-T-G-A G-T-G-A-T-G G-T-A-G-T-A T-A-G-T-A-C G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C G-T-A-G-T-A-C A-C-T-A-C Nối được Nối được Không đượchttp://buihongquan.com Kỹ thuật lai acid nucleic • Là sự bắt cặp bổ sung đặc hiệu của hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Các yếu tố ảnh hưởng – Nồng độ ADN và thời gian phản ứng – Nhiệt độ – Độ dài của các trình tự – Lực ionhttp://buihongquan.com Kỹ thuật lai acid nucleic • Southern Blot: lai ADN Chiết tách ADN vi khuẩn • Northern Blot: lai ARN ADN đích Gắn ADN vào màng Màng • Lai tại chỗ (in situ) B B Lai với đ o ạ n d ò đánh Đ ò được đánh • Mẫu dò (probe) d ấ u b ằ n g b i o t i n o ạ n d d ấ u b i o t i n B B • Hệ thống phát hiện – Phóng xạ Streptavidin – Enzym B B – Huỳnh quang AP ...