Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN

Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN - ThS. Nguyễn Thanh Tố Nhi cung cấp cho học viên những kiến thức về chiết tách ADN; các phương pháp phân tích định tính và định lượng acid nucleic; kỹ thuật cắt, nối, lai ADN và ứng dụng; các phương pháp xác định trình tự ADN; kỹ thuật PCR;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp phân tích ADN Phương pháp phân tích ADN 1
CHIẾT TÁCH ADN CÁC PP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC
CÁC KỸ THUẬT CẮT, NỐI, LAI ADN VÀ ỨNG DỤNG
KỸ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ADN
CÁC
KỸ THUẬT PCR Phương pháp chiết tách ADN Phương pháp chiết tách ADN  Nguyên tắc chung: 3 bướ ước – Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học họ – Chiết tách acid nucleic:: Phenol-Chloroform Phenol  loại Protein trong pha tủa, thu ADN trong pha tan – Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt tuy ñối hoặc isopropanol, … Phương pháp chiết tách ADN  Các trường hợp cụ thể: – Plasmid: loại NST bằng sự khác khá nhau về cấu dạng - kích thước – ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid – Tế bào Thực vật: phá tế bào o bằng cách nghiền – Tế bào ðộng vật: phá tế bào o bằng enzym - chất tẩy Tinh chế acid nucleic  Ly tâm phân ñoạn:: acid nucleic ñược siêu ly tâm trong thang t trọng saccarose hay CsCl2 (lượng lượng acid nucleic cần tinh chế lớn  Sắc ký • Lọc gel: tách acid nucleic theo kích thước phân tử ở qui mô lớn • Trao ñổi ion trên vi cột  thu hồi những lượng ADN rất nhỏ • HPLC:ñối với các oligonucleotide, ñộ phân giải cao (1 nucleotid • Hấp phụ (ái lực): mARN ñược hấp phụ bằng resin có gắn oligo dT hay dU. • ðiện di gel, polyacrylamid ðịnh tính - ñịnh lượng ng acid nucleic  ðịnh lượng = Quang phổ ph kế: – Nguyên tắc: sự hấp thụ̣ mạnh của base ở λ = 260 nm – 1 ñơn vị OD260nm tương ñương nồng ñộ:  50 µg/ml dung dịch ADN (hoặc ( ARN) sợi ñôi  40 µg/ml dung dịch ARN (hoặc ( ADN) sợi ñơn  20 µg/ml oligonucleotid (tới tới 70 base) – ðộ tinh khiết: OD260/230 hoặc ho OD260/280 và OD320nm(ADN tinh khiết: 1.8 ≤ OD260/280 280 ≤ 2). ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic  Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện tron gel – Định tính theo kích thước khi so với chuẩn – Định lượng bằng so sánh vớ ới chuẩn  Nguyên tắc:  ADN tích điện âm, di chuyển về cực dương  Hệ gel: agarose hay acrylamide  Tốc độ điện di ADN qua gel tùy thuộc vào:  Kích thước ADN  Cấu dạng ADN: siêu xoắn, vòng, vòng thẳng  Nồng độ gel  Điện thế ðịnh tính - ñịnh lượng acid nucleic  Điện di trong trường xung (đổi hướng điện trường): ph tích ADN lớn (>50kb)  ADN NST ĐV có vú kích thước lớn: thủy phân với RE trước khi phân tích ðiện di CẮT, NỐI, LAI ADN & ỨNG DỤNG  CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN (RE)  CÁC LIGASE & ỨNG DỤNG ðỂ NỐI CÁC ð0ẠN ACID NUCLEIC  KỸ THUẬT LAI NUCLEOTID & ỨNG DỤNG CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN  Cấu tạo: – Enzym cắt hạn chế (restriction enzym - RE): các endonuclease cắt ADN tại hay gần một trình tự nhận diện ñặc hiệu.  Chức năng – Cắt và thoái hóa các ADN ngoại lai (ví dụ ADN phage)  bộ gen của vi khuẩn ñược ổn ñịnh. CẮT ADN BẰNG ENZYM CẮT GIỚI HẠN I & III II Hoạt tính Endonuclease Endonuclease Metyl hóa ATP Cần Không Vị trí cắt Khá xa ñiểm nhận diện Tại hoặc rất gần vị trí nhận diện Ứng dụng Ít Phổ biến trong nghiên cứu Danh pháp 3 ký tự Latin (in nghiêng) nghiêng - tên chi và loài (ký tự thứ tư ñể chỉ chủng (strain) hoặc plasmid), 1 số La mã - thứ tự phát hiện enzym. VD: BamHI: là RE của Bacillus amyloliquefaciens chủng H, ñược phát hiện ñầu tiên. ðặc ñiểm RE loại II và các cá kiểu cắt của nó  Trình tự nhận diện cắtt gồm 4-8 nucleotid, thường có kiểu palindrome (2 mạch của tt hoàn toàn giống nhau khi ñọc theo chiều 5’ – 3’), Kiểu cắt: – ðầu tù: cắt hai mạch tại tạ cùng một ñiểm – ðầu so le/dính: cắt mỗi mạch tại một ñiểm khác nhau  Ứng dụng – Cắt ADN trong kỹ thuật tái tổ hợp di truyền – Phân tích ña hình cắt giớ ới hạn  ñịnh danh, phân biệt ðầu cắt của RE -AATCAGCTGTTA- -TAAGGATCCAAA- -TTAGTCGACAAT- -ATTCCTAGGTTT- Cắt với HaeIII Cắt với BamHI -AATCAG CTGT ...