Báo cáo THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO SINH DƯỠNG CỦA BÒ RỪNG Bos javanicus NHẰM BẢO TỒN NGUỒN GIEN CẤP ĐỘ TẾ BÀO

Bò rừng Bos javanicus (Wagrer, 1844) thuộc họ Bovidae, l à loại thú cỡ lớn, có trọng lượng cơ thể 600 - 800kg. Bò rừng thích sống ở những v ùng rừng thưa thoáng mát, nhất là rừng khộp hoặc những khu rừng rậm có thung lũng có nhiều cỏ. Ở Việt Nam, trước đây bò rừng có nhiều ở các tỉnh Đồng N ai (Biên Hoà, La Ngà…), Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận (Phan Rí - Phan Thiết), Lâm Đồng, Đắc Lắc… ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo " THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO SINH DƯỠNG CỦA BÒ RỪNG Bos javanicus NHẰM BẢO TỒN NGUỒN GIEN CẤP ĐỘ TẾ BÀO "316 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 THU NH ẬN VÀ NUÔI C ẤY TẾ BÀO SINH DƯỠNG CỦA BÒ RỪNG Bos javanicus NHẰM BẢO TỒN NGUỒN GIEN CẤP ĐỘ TẾ B ÀO Hoàng Ngh ĩa Sơn, Trần Cẩm Tú , Viện Sinh học Nhiệt đới Lê Văn Ty , Viện Công nghệ Sinh họcMỞ ĐẦU Bò rừng Bos javanicus (Wagrer, 1844) thuộc họ Bovidae, l à loại thú cỡ lớn, cótrọng lượng cơ thể 600 - 800kg. Bò rừng thích sống ở những v ùng rừng thưa thoáng mát, nhất là rừng khộp hoặcnhững khu rừng rậm có thung lũng có nhiều cỏ. Ở Việt Nam, trước đây b ò rừng có nhiều ở các tỉnh Đồng N ai (Biên Hoà, LaNgà…), Bà Rịa - Vũng T àu, Bình Thu ận (Phan Rí - Phan Thi ết), Lâm Đồng, Đắc Lắc…Đây là loài thú quý hiếm của rừng nhiệt đới, th ường bị săn bắn ở nhiều nơi nên đangđứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Trong Sách Đỏ Việt Nam (2000), bò r ừng được xếp ởcấp độ V (sẽ nguy cấp) [1]; trong Danh lục Đỏ của IUCN (2004), b ò rừng ở mức EN(nguy c ấp) [2]; c òn trong Ngh ị định 48/2002/NĐ -CP của Chính phủ, b ò rừng được xếptrong Phụ lục IB [3]. Do vậy, vấn đề bảo tồn nguồn g en là m ột trong những nhiệm vụchiến lược của công nghệ sinh học Việt Nam . Trên cơ sở tế bào sinh dưỡng của lo ài bò rừng có khả năng phát triển trong môitrường DMEM được bổ sung huyết thanh, đồng thời dựa vào nh ững điều kiện sẵn cócủa phòng thí nghi ệm, chúng tôi đ ã tiến hành thu nh ận và nuôi cấy tế bào sinh dưỡngcủa bò rừng nhằm bảo tồn nguồn gien ở cấp độ tế b ào và làm nguyên li ệu để tạo d òngvô tính v ề sau này. Kết quả thu được là tế bào sinh dưỡng của bò rừng phát triển tốt trong môi tr ườngDMEM được bổ sung 10% huyết thanh của b ào thai bê và đ ã thu được số lượng lớn tếbào fibroblast c ủa bò rừng.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG P HÁP Hóa ch ất: Dung d ịch PBS( -); cồn 70o (China); môi trường DMEM (Gibco); FBS(Gibco); trypsin (Sigma); EDTA (Merk); Polyvinyl alcohol (China); L - glutamine (Sigma); D-glucose (Sigma) Vật liệu: Mẫu mô của tai b ò rừng được thu nhận tại cơ sở nuôi thú hoang d ã ở khu vực Tuyền Lâm, th ành phố Đà Lạt. Phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nhiệt đới và Trường Đại học Quốc gia Thành ph ố Hồ Chí Minh. 317Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Phương pháp thu nh ận v à xử lý mẫu: M ẫu tai b ò rừng sau khi được thu nhận, được rửa sạch trong môi tr ường PBS( -); m ột nửa cho v ào týp đông lạnh chứa 1ml PBS 10% DMSO đ ể đông lạnh. Nửa c òn l ại cho v ào effendorf chuy ển về phòng Thí nghi ệm tế bào động vật, Viện Sinh học Nhi ệt đới. Mẫu tai b ò r ừng được xử lý qua những b ước sau: effendorf chứa mẫu đ ược xịt cồn 70 o rồi đưa vào t ủ vô tr ùng. M ẫu được rửa qua dung dịch PBS ( -) 3 l ần, rồi tiến h ành c ạo s ạch lông. Sau đó, ngâm mẫu v ào c ồn trong v òng 10 giây và r ửa lại 3 lần bằng dung d ịch PBS( -). Phương pháp nuôi sơ c ấp mẫu mô: Ti ến h ành c ắt nhỏ mẫu mô th ành nh ững m ảnh có kích thước 0,5x0,5mm. Sau đó, gắp những mảnh mô v ào đĩa nhựa 4 gi ếng. Mỗi giếng từ 4 đến 5 mảnh mô. Chờ từ 20 đến 30 phút để mẫu mô cố định tr ên m ặt đĩa. Sau khi mẫu đ ã cố định, bổ sung 400µl môi tr ường DMEM 10%FBS và chuy ển v ào t ủ ấm 37 - 38 oC; 5%CO 2 đ ể nuôi cấy. Sau mỗi 24 giờ, ki ểm tra v à ghi nh ận h ình ảnh. Phương pháp c ấy chuyền: M ẫu mô được nuôi sau 5 ng ày, g ắp bỏ mảnh mô v à b ổ sung môi trường. Quan sát sự phát triển của nguy ên bào s ợi, khi thấy tế b ào lan h ết mặt đĩa th ì ti ến h ành c ấy chuyền. Hút bỏ hết môi tr ường cũ ra, bổ sung vào 200µl trypsin/EDTA 0,25%; l ắc nh ẹ đĩa để tế b ào tách kh ỏi mặt đĩa; quan sát dưới kính hiển vi, khi thấy tế b ào bung ra h ết th ì b ổ sung th êm 200µl môi trường DMEM 10%FBS để bất hoạt trypsin. Hút 200µl huyền ph ù t ế b ào vào đĩa 4 giếng mới v à b ổ sung thêm 200µl môi trư ờng DMEM 10%FBS. Ti ếp tục nuôi trong t ủ ấm 5%CO 2. Sau m ỗi 24 giờ, kiểm tra v à ghi nh ận h ình ảnh.KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN1. Kết quả nuôi cấy sơ cấp mẫu mô da tai b ò rừng Khi được nuôi nguyên phát từ mảnh mô, các nguyên bào sợi tăng sinh rất nhanh, di cư rakhỏi mẫu mô ban đầu v à phát triển rất tốt sau khi gắp bỏ mảnh mô ra khỏi môi tr ường nuôi cấy. Có thể quan sát được rất nhiều tế bào phân chia trong đĩa nuôi với nhiều hình dạng khácnhau; sau 4 ngày, t ế bào mọc lan ra và sau 10 ngày, tế bào lan hết bề mặt đĩa 4 giếng v à có thểtiến hành cấy chuyền ra đĩa 4 giếng mới. Hình 1. Sau 4 ngày nuôi s ơ cấp Hình 2. Sau 10 ngày nuôi318 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Hình 3. T ế bào sau ...