BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME

Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. - Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký. - Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein trong mẫu. i ion (Ion –Exchange Chromatography): chung: - Sắc ký là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp và được tiến hành lần đầu bởi nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------  ------ BÁO CÁO THỰC HÀNHMÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Sinh viên thực hiện : Đinh Hoàng Yến Lớp : K55 - CNSHB Mã sinh viên : 550513 Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thành Trung Hà Nội, 2012 1 Bài g à r o i ionI – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. - Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký. - Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein trong mẫu. – h ng h 1. r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): chung: - Sắc ký là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp và được tiến hành lần đầu bởi nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. - Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh là hợp chất có khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit). - Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh). - Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Hóa sinh.Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký ái lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp. - Trước tiên, chất cần phân tích sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu. - Sau đó, các ion đã trao đổi được chiết rút riêng biệt bằng phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy. Có thể tách chiết bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên chất phân tích bị mất điện tích. b) : - Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. - Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi. Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra. - Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích). - Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất 2 định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl- cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. c) - Có độ phân giải cao. - Đa dạng. - Dễ dàng tiến hành.2. g (Gel-Filtration Chromatography): Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio- gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0,1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào ...