Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh các mẫu nấm Cordyceps và các chi lân cận bằng phát sinh chủng loài phân tử đa gen

Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học. Bài viết tiến hành xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian nói chung và Việt Nam nói riêng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bước đầu xây dựng phương pháp luận hỗ trợ định danh các mẫu nấm Cordyceps và các chi lân cận bằng phát sinh chủng loài phân tử đa gen Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 1 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG LOÀI PHÂN TỬ ĐA GEN (ON THE FIRST STEPS TOWARDS A METHODOLOGY TO ASSIST IN THE IDENTIFICATION OF CORDYCEPS AND RELATED FUNGI BY MULTIGENE PHYLOGENETICS) Trịnh Văn Hạnh, Ngô Thị Diệp, Nguyễn Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Lao Đức Thuận* Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh SUMMARY A methodology was created to assist in the identification process of entomopathogenic fungi (Cordyceps, Clavicipitaceae), a genus with a diverse species content and therapeutic applications. The method was formed from creating a reference dataset to assist in the identification process of several samples. (1) The dataset includes database of nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Tub and Atp6 for related fungi; (2) Gene sequences obtained from fungal samples of Lang Bian, Lam Dong through DNA extraction by phenol/chloroform method with the assist of β-mercaptoethanol and CTAB; (3) Molecular phylogenies were analyzed on single gene and multigene trees by MEGA 6.0 software with different tree construction methods (Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML). Boostrapping was included to support tree branches. The molecular method with the combination of molecular biology and bioinformatics was completely in agreement with morphological-based methods. As a result, DL0038A and DL0038B were reconfirmed as Cordyceps takaomontana (Anamorphic form: Isaria tenuipes), DL004 was reconfirmed asCordyceps neovolkiana.DL0067 was in a very close relationship or is Isaria. tenuipes, DL0075 was in a very close relationship or is Cordyceps. staphylinicola. DL0069 and DL0077 were in a very close relationship with Simplicillium lamellicola or Simplicillium lanosoniveum. Keywords: Molecular phylogenetics, Cordyceps, Clavicipitaceae, Entomopathogenic fungi. MỞ ĐẦU Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ với chi nấm này do (1) sự đa dạng về đặc Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps điểm, cấu trúc của các loài nấm thuộc họ sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất Clavicipitaceae, (2) hệ thống định danh nhóm quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học[3]. nấm tồn tại thể lưỡng danh là hữu tính Hiện nay, nghiên cứu không chỉ tập trung vào (teleomorph) và vô tính (anamorph) gây phức loài Cordyceps sinensis mà còn mở rộng tạp hóa quá trình định danh[3]. Vì vậy, việc nghiên cứu đến nhiều loài thuộc họ xây dựng một phương pháp luận dựa trên việc Clavicipitaceae, các loài này được cho rằng có phân tích cây phát sinh loài phân tử nhằm hỗ các hoạt tính y dược quý như C. sinensis[4]. trợ cho công tác định danh nấm này đã được Tuy nhiên, việc định danh các loại nấm thuộc chúng tôi tiến hành. chi này đều dựa trên phân tích hình thái của Phương pháp luận được xây dựng dựa trên Kobayashi(1982)(được xem là tiêu chuẩn sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học ứng vàng trong định danh) gặp nhiều khó khăn đối dụng trong việc xây dựng cây phát sinh sinh Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 2 loài đơn gen hay đa gen. Nền tảng của phương tin cậy của cây phát sinh loài và quá trình định pháp luận là (1) sinh học phân tử (gồm chủ danh nấm ký sinh côn trùng (Sung et al., yếu là PCR và điện di giải trình tự) và (2) tin 2007). sinh học (gồm xây dựng cơ sở dự liệu (CSDL), Trong nghiên cứu này, Chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài phân tử).Trên thế xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh giới, việc nghiên cứu phát sinh loài ứng dụng học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh trong hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian đã được nghiên cứu trước đây, chẳng hạn nói chung và Việt Nam nói riêng. Đồng thời Sung et al. (2007) đã sử dụng dữ liệu 5 – 7 gen phương pháp luận được kiểm định bởi các bao gồm nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, Atp6, tub mẫu nấm kí sinh côn trùng đã được định danh và tef1 để tiến hành phân tích, nghiên cứu sâu hình thái gồm: DL004: Cordyceps nevolkiana, về quan hệ giữa các chi thuộc họ DL0038A: Cordyceps takaomontana, Clavicipitaceae, kết quả của nghiên cứu này DL0038B: Cordyceps takaomontana, đã tái sắp xếp lại các chi liên quan. Bộ dữ liệu DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium công bố của Sung et al. (2007) là dẫn liệu đối sp., DL0075: Cordyceps sp., DL0077: chứng chính trong cây phát sinh loài mà chúng Simphicillium sp. (Đinh Minh Hiệp, Trương tôi xây dựng. Thông tin trên cho thấy sự kết Bình Nguyên, 2015). hợp đa gen góp phần hỗ trợ làm tăng mức độ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Kế thừa kết quả nghiên cứu trước của nhóm Phản ứng PCR được thực hiện trên máy TS. Trương Bình Nguyên và TS. Đinh Minh Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương Hiệp (2005), trong công bố này chúng tôi sử trình nhiệt bao gồm 95 ºC trong 5 phút (1 chu dụng 7 mẫu nấm được phân thành 2 nhóm kỳ), 40 chu kỳ lặp lại với 95 ºC - 30 giây, X chính gồm (1) DL004, DL0038A, DL0038B ºC - 30 giây, 72 ºC - 2 phút và 72 ºC - 5 phút là nhóm được định danh hình thái đến mức (1 chu kỳ) (X là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho loài, được xem là nhóm đối chứng để kiểm tra mỗi gen nrLSU: 55oC, nrSSU: 42,5oC, Tef1: phương pháp luận mà nhóm xây dựng; đặc 55oC, Rpb1: 46,3oC, Tub: 58,5oC, Atp6: biệt trong nhóm này: hai m ...