Các phương pháp chẩn đoán phát hiện Rotavirus

Trong đó, hiện nay ELISA được xem là phương pháp thích hợp cho các phòng chuẩnđoán bởi tính nhạy, tính đặc hiệu khá cao và dễ thao tác. Tuy nhiên trong các nghiên cứuvề dịch tễ học cần có những phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện, thúcđẩy sự ra đời của các phương pháp mới như Multiplex RT-PCR, Sequencing, Real-timePCR …
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp chẩn đoán phát hiện RotavirusSEMINAR VIRUS HỌC 1 Các phương pháp chẩn đoán phát hiện Rotavirus : 7Các phương pháp chẩn đoán phát hiện Rotavirus bao gồm: − Nuôi cấy phân lập − Quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử - Electron Microscopy (EM) − Passive Latex agglutination assays (LA)(xét nghiệm sự dính kết bị động) − Phát hiện các serotype (kiểu huyết thanh) bằng thử nghiệm trung hòa với kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho từng serotype (EIA-Mabs) − Electropherotyping using polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE ) − ELISA − Reverse transcription-PCR − Microarray trong nghiên cứu về dịch tễ học Trong đó, hiện nay ELISA được xem là phương pháp thích hợp cho các phòng chuẩnđoán bởi tính nhạy, tính đặc hiệu khá cao và dễ thao tác. Tuy nhiên trong các nghiên cứuvề dịch tễ học cần có những phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu quả phát hiện, thúcđẩy sự ra đời của các phương pháp mới như Multiplex RT-PCR, Sequencing, Real-timePCR … Sự tiến hóa của Rotavirus bằng nhiều cơ chế khác nhau là một thách thức lớn trongnghiên cứu về dịch tễ học. Sự lan truyền virus giữa các loài đóng vai trò quan trọngtrong sự đa dạng của Rotavirus. Rotavirus có khả năng trao đổi vật chất di truy ền khiđồng nhiễm với một virus khác trong một tế bào và tạo ra virus mới; hoặc virus tích lũycác đột biến điểm tạo ra những chủng đột biến thoát khỏi sự trung hòa bởi kháng thể.Do đó các phương pháp typing virus cần phải đuợc giám sát và update thuờng xuyên. Phương pháp EM ra đời năm 1974 bởi Flewett và phương pháp LA là những phươngpháp đầu tiên đuợc sử dụng phát hiện Rotavirus, đến nay thì các phương pháp này ítđược sử dụng do tốn nhiều thời gian, nặng nề về thao tác và bị hạn chế khi số l ượngmẫu lớn. Thay vào đó Elisa được xem là sự lựa chọn tối ưu trong chẩn đoán lâm sàng. 7.1 Phương pháp ELISA : Có nhiều qui trình khác nhau để phát hiện Rotavirus dựa vào ELISA nhưng đều dựatrên nguyên tắc trung hòa giữa kháng nguyên bề mặt virus và các kháng thể đơn dòngCao học khóa 20 Nhóm 14 – Vi sinh K20SEMINAR VIRUS HỌC 2đặc trưng. Ở đây xin nêu lên phương pháp phát hiện Group A Rotavirus, các serotypecủa group này và các subgroup. a/ Phát hiện nhóm A Rotavirus : Mẫu phân lâm sàng được phân tích bằng indirectELISA. Mẫu được xác nhận là nhóm A Rotavirus nhờ sử dụng ELISA dựa vào khángthể đơn dòng đặc hiệu cho group A (Mab-YO-156 và YO-2C2 (kháng thể cho phản ứngchéo với protein VP4). Mẫu huyết thanh được ủ với các kháng thể đơn dòng, các Mabsnày sẽ bắt lấy các kháng nguyên virus sau đó người ta bổ sung kháng thể đa dòng đ ặchiệu cho từng serotype có gắn với Biotin để phát hiện bổ sung peroxidase gắnstreptavidine ủ 37oC trong 1h bổ sung o-phenylenediamine phản ứng được thực hiệnở 37oC trong 30 phút ngừng phản ứng bằng acid sulphuric. Độ hấp thu đuợc đo ở492nm trong máy đọc ELISA. Chứng + là chủng Rotavirus Wa và một mẫu không cóRotavirus làm chứng âm. b/ Serotyping Rotavirus : Mẫu dương tính với nhóm A đựơc xác định tính đặc hiệuserotype bằng ELISA sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với từng serotype, cáckháng thể này nhận ra từng epitope trung hòa trong protein vỏ capsid ngoài- vp7 đ ặchiệu cho từng serotype. Lượng Mabs đặc hiệu serotype (KU6BG (serotype 1) ; S2-2G10(serotype 2); YO-lE2(serotype 3); ST-2G7 (serotype 4) ) pha loãng trong buffercarbonate-bicarbonate. Một serotype được xác định khi giá trị OD của phản ứng với Mabtương ứng cao hơn 0.5 và ít nhất gấp 2 lần giá trị OD trung bình của 3 Mabs khác phảnứng với cùng mẫu đó c/ Subgroup của Rotavirus : subgroup của Rotavirus được thực hiện bởi ELISA sửdụng Mabs đặc hiệu cho các subgroup. S2-37 (subgroup I), YO-5(subgroup II). Qui trìnhthực hiện tương tự như ELISA phát hiện nhóm A virus và serotype. 7.2 PAGE : Electrophoretic RNA genome của Rotavirus bằng điện di trên gel Polyacrylamide (phương pháp này chủ yếu dùng trong nghiên cứu dịch tễ học Rotavirus ) Rotavirus có bộ gen dsRNA gồm 11 đoạn gói trong 3 lớp vỏ protein. Rotavirus baogồm các nhóm virus khác nhau về tính đặc hiệu kháng nguyên cũng như có độ đa dạngdi truyền cao. Bằng phương pháp Polyacrilamide gel electrophoresis có tính nhạy và đặchiệu cao nhằm xác định nhóm virus nào phổ biến trong cộng đồng. Điện di bộ gen củaRotavirus cho phép phát hiện và phân loại virus thành 2 nhóm electrophoretic profile dài(L) và ngắn (S) dựa vào kiểu hình di chuyển của gen segment 10 và 11 trên gelCao học khóa 20 Nhóm 14 – Vi sinh K20SEMINAR VIRUS HỌC 3polyacrylamide. Sự thay đổi trong di động của một hoặc nhiều segment bất kỳ cũng chophép ta phát hiện các chủng Rotavirus khác nhau.Qui t ...