Chỉ thị phân tử: Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầunhững năm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấuvân tay di truyền (fingerprinting) phổ biến nhất trên toàn thế giới.Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kỹ thuật RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đạinhững đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởienzyme cắt hạn chế.Phương pháp có độ nhạy cao trong việc tìm dấu vết của DNAcủa bất kỳ nguồn gốc nào hay sự phức tạp nào...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chỉ thị phân tử: Kỹ thuật AFLP ĐẠIHỌCKHOAHỌCHUẾ KHOASINHHỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ KỸ THUẬT AFLP(Amplified fragment length polymorphisms) Giảngviên: Họcviên: TS.NguyễnThịThuLiên NguyễnHữuNhân NguyễnBảoTriệu Huế - 12/2011 NỘI DUNG TRÌNH BÀY1. Giớithiệu.2. NguyênlýcủakỹthuậtAFLP.3. Hóachất,dụngcụ,trangthiếtbị.4. Ứngdụng.5. KỹthuậtcDNAAFLP.6. Ưu,nhượcđiểm7. Kếtluận.8. Tàiliệuthamkhảo. Giới thiệu KỹthuậtAFLPđượcpháttriểnbởicôngtyKeyGenetrongđầunhững năm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấuvântayditruyền(fingerprinting)phổbiếnnhấttrêntoànthếgiới. KỹthuậtAFLPdựatrênnguyênlýkếthợpgiữakỹthuậtRFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đại những đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởienzymecắthạnchế. Phươngphápcó độnhạycaotrongviệctìmdấuvếtcủaDNAcủabấtkỳnguồngốcnàohaysựphứctạpnào CóthểthựchiệnvớiDNAcủatoànhệgenhayvớicDNA(bảnsaonguyênbản). Kỹthuật AFLP đượccấpbằngsángchếvàonăm1991vàtạithời điểmnày đượcbanhành ởnhiềuquốcgia như Canada,Châu Âu,NhậtBản,ÚcvàMỹ.Hiệnnayđãđượcứngdụngrộngrãitrênthếgiới. Nguyên lý của kỹ thuật AFLPDNAđượcphângiảibởihaienzymecắthạnchếkhácnhau. Phần nối (adapter) oligonucleotide được nối với những đầu tận cùngcủacácphânđoạnDNA.TậpconđặctrưngcủacácsảnphẩmphângiảiDNAđượckhuyếchđại,sửdụngkếthợpcácprimerchọnlọc.Pháthiệnsự đahìnhcóthể đượcthựchiệnvớicác đồngvịphóngxạ,nhuộmcácmàuhuỳnhquanghaynhuộmbạc.Nguyên lý của kỹ thuật AFLP Hình1.TổngquanvềkỹthuậtAFLP Nguyên lý của kỹ thuật AFLP1. Enzymecắthạnchế(RE): SửdụngcácREloạiII Thườngsửdụnghaienzynecắthạnhạnchếkhácnhau:EcoRIvàMseI HaiREkhôngcắttạicùngmộtvịtrínhậnbiết MboIvaSau3AI ̀ BamHI:TấtcảcácREsaukhicắtphảitạorađầulồi Nguyên lý của kỹ thuật AFLP1. Enzymecắthạnchế(RE): KếtquảsaukhicắtbằngRENguyên lý của kỹ thuật AFLP2.Phầnnối(adapter) Saukhicắtbằng2RE,thì2 đầu đoạnDNA đượcgắncácadapterbằngenzymeligase Đoạnadaptergồmhaiphần:phầntrìnhtựlõivàphầntrìnhtự đặchiệuchovịtrícắtenzymeNguyên lý của kỹ thuật AFLP3.PCRMồicủaPCRđượcthiếtkếdựtrêntrìnhtựadaptervàmộttrìnhtựchọnlọckhoảngvàinucleotideChỉnhữngphânđoạnnàochứacảtrìnhtựadaptervàtrìnhtựchọnlọcmớiđượcchọnlọcChínhtrìnhtựchọnlọcsẽlàmgiảmsựxuấthiệnsảnphẩmPCRvàlàmđơngiảnquátrìnhphântíchQuátrìnhPCRgồmhaiphảnứng(preselectivePCR)vàselectivePCRNguyên lý của kỹ thuật AFLP3.PCR•PreselectivePCR:Sửdụngprimer+1nucleotideNguyên lý của kỹ thuật AFLP3.PCR•SelectivePCR:Sửdụngprimer+1+2nucleotide Nguyên lý của kỹ thuật AFLP4.PháthiệnsựđahìnhTrườnghợpprimercógắnđồngvịphóngxạhoặchóachấtphátquangthìđượcpháthiệnbằnghệthốngPCRcóthuvàxửlýtínhiệuphátquangNguyên lý của kỹ thuật AFLP4.PháthiệnsựđahìnhTrườnghợpprimerbìnhthườngthìsaukhichạyPCR,mẫusẽđượcđiệnditrêngelvànhộmgel Pristionchus pacificus: C: California P: Poland H: Hawaii W: WashingtonKỹ thuật cDNA-AFLP*PhânlậpmRNAtừmẫuquantâm*SaochépngượccủamRNAbằngcáchsửdụngprimeroligodTtổnghợpcDNA* Các bước tiến hành cắt hạn chế, PCR, pháthiện đa hình tương tự như ở DNA.Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bịNguồn Nướccấtvà(hoặc)nướcđãkhửion(deionisedwater) HoáchấtTrangthiếtbị Dụngcụ Tủlạnh,tủđôngsâu CácloạiMicropipettevàpipette Laminarcódònghútkhí tiptươngứng(đầucôn) Máylitâm Cácloạitubeeppendorf MáyPCR Cốichàysứ MáyđopH Cânchuẩn Găngtay Máyđiềuchỉnhnguồnđiện Máyđiệndiphươngthẳngđứng Lòhâm(hotplate) Máygiảitrìnhtựtựđộng hoặclòvisóng(Microwave) Máysoibằngcựctím (UVtransilluminator) Ứng dụngĐánhgiáđadạngditruyềnPhântíchđộdàiditruyềnKiểmtradấuhiệuditruyềnPhântíchbộsưutậpnguồngene(germplasmcollections)XâydựngbảnđồgeneQuảnlýcácchỉthịthămdò Ưu, nhược điểm Ưuđiểm: AFLPnhanh, đơngiảnkhôngphứctạpnhưRFLPnhưngvẫnkhảosátđượctoànbộgen. KỹthuậtnàychỉcầnlượngítDNAbanđầu Khôngcầnbiếttrướctrìnhtựđích Cóđộlặplạiphảnứngcao Cácmồisửdụngkhôngcầnđặchiệuloài Khuếch đạicóchọnlọcmộtlượnglớncác đoạnDNA đahìnhtrongmộtphảnứngPCR,phùhợpchoviệcphântíchđadạnggiữacácquầnthểcóquanhệgầnnhau. Ưu, nhược điểmNhượcđiểm:• AFLPstạoramộtlượnglớnthôngtincầnphải đượcphân tích tự động, vì thế cần sự giúp đỡ của kỹ thuật máy tính cao• AFLPlàmộtmarkertrội,điềunàylàmhạnchếphânbiệt cáthểđồnghợpvàdịhợp• Trongxâydựngbản đồditruyền,AFLPsthườngtậptrung lạiởvùngcentromeresvàtelomeres• Nhânviênphảicókỹthuậtphòngthínghiệmvàđặcbiệtlà phântíchdữliệu Kế tKỹ thuật AFLP dựa vàoận lu sự khuyếch đại chọn lọc cácphânđoạnhạnchếsaukhiphângiảiDNAN ...