Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA

Sự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lần Số lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũ Một polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương VI: CHỌN LỌC GiỐNG NHỜ MARKER PHÂN TỬ DNA CHƯƠNG VICHỌN LỌC GiỐNG NHỜMARKER PHÂN TỬ DNA Các khái niệm cơ bảnViệc phát minh ra máy chu kỳ nhiệt (thermocycler) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như Taq đã giúp cho Kary Mullis đoạt giải Nobel 1993.PCR (polymerase chain reaction) phản ứng chuổi polymerase bao gồm:1- Biến dây đôi thành dây đơn2- Phản ứng của primer gắn vào dây chuổi mã trên dây template (gọi là tiến trình annealing) để có phân tử DNA mới.3- Kéo dài dây mới nhờ primer (extension) Các khái niệm cơ bảnSự phát triển và phân lập DNA polimerase có tính ổn định rất cao đối với nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chịu nhiệt là Taq cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi, lặp lại nhiều lầnSố lượng khyếch đại tăng theo hàm số mũMột polimerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA Taq (Thermus aquaticus)• Taq là vi khuẩn có tính chịu nhiệt• Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nhảy vào làm sai lệch kết quả.• Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn Deoxynucleotide triphosphate• Hàm lượng deoxynucleotide trong khoảng 20 đến 200mM cho kết quả ổn định, trung thực, và chuyên tính.• Bốn dNTP được xử lý sao cho nồng độ chúng tương đương nhau, để giảm thiểu tối đa hiện tượng sai biệt do kết hợp sai mã di truyền nào đó. Magnesium chlorideNồng độ Mg2+ có thể ảnh hưởng đến :• Quá trình anneling của primer.• Nhiệt độ để tháo dây thành dây đơn.• Sự chuyên tính của sản phẩm PCR.• Hoạt động của enzym và sự trung thực của kết quả.PCR sẽ cần một hàm lượng Mg từ 0,5 đến 2,5mM ứng với hàm lượng tổng số dNTP đã cho. Cặp mồi primerRAPD: Chiều dài ngắn 10-16 merTi thể, microsatellite dài 20-24 merNồng độ cao không những không cần thiết mà tạo ra bất lợi, vì quá thừa primer, dẫn đến sự hình thành hiện tượng primer dimers, và hiện tượng priming nhằm Nhiệt độ annealingTd = 4 (G + C) + 2 (A + T) đối với primer có khoảng 20 oligonucleotideSố base càng ít, nhiệt độ càng thấp, và ngược lại Phản ứng dung dịch đệmTính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCRNồng độ của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự mở dây đẻ cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi. Phản ứng dung dịch đệmLượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng anneling giả xảy ra thêm ổn định hơn, tại những vị trí không đúng của dây đơn, cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp.nồng độ Mg2+ quá thấp ( DNA templateKhi khuyếch đại vùng mục tiêu từ dây đơn DNA, số lượng của template được tính toán trên cơ sở mol. Phép tính này giúp chúng ta xác định số lượng DNA cần phải có, số chu kỳ để tổng hợp ra DNA với số lượng mong muốn. Tỉ lệ giữa primer : template• Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer- dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quá loãng. nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR không nhiều.• Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer để tránh hiện tượng primer-dimers. Thiết kế primer• Nhiệt độ khác nhau giữa cặp mồi xuôi và ngược không quá 3oC.• Tỉ lệ GC trên 50%.• Chiều dài của mỗi primer là 18 bp và 24 bp.• Cặp mồi không tận cùng GC.• Dựa vào chương trình phần mêm để thiết kế. Ứng dụng các CNSH trong Thủy sản.Ph¬ng ph¸p Rando m Amplifie d Po lymo rphis m DNARAPD: DNA ®a h×nh khuyÕc h ®¹i ng Éu nhiªnP h¬ng ph¸p Re s tric tio n Frag me nt Le ng th Po lymo rphis mRFLP: §a h×nh c hiÒu dµi ph©n ®o ¹n c ¾t h¹n c hÕPh¬ng ph¸p mic ro s ate llite : §a h×nh vÒ s è ph©n ®o ¹nn uc le o tide ng ¾n (26) lÆp l¹i ë mé t lo c us mic ro s ate llitePh¬ng ph¸p Amplifie d Frag me nt Le ng th Po lymo rphis mAFLP: §a h×nh c hiÒu dµi ph©n ®o ¹n khuyÕc h ®¹iPh¬ng ph¸p S ing le Nuc le o tide Po lymo rphis m S NP: §ah ×nh nuc le o tide ®¬n Microsatellite § a h×nh vÒ s è ph©n®o ¹n nuc le o tide ng ¾n (26) lÆp l¹i ë mé t lo c usPhương pháp kinh điển- Ly trích DNA- Cắt với enzyme hạn chế- Nối kết và chuyển đổi- Nuôi cấy khuẩn lạc- Hybridise- Phân lập plasmid- Chạy trình tự- Thiết kế primer ISOLATION, CHARACTERISATION, AND AMPLIFICATION OF MICROSATELLITE MARKERS: PROTOCOL BREAKDOWN STRUCTURE DOT-BLOT: microsatellite presence/density (Facultative)•Extract DNA Cloning vector•Cut DNA with SAU 3A (cut with BAM HI)•Size-select fragments (400-900 pb) low insert size poor Ligate ligation ...