Enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khungDNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Enzyme giới hạn Enzyme giới hạnEnzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) làmột enzyme endonuclease có vị trí nhận biếtđiểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme nàyphân huỷ liên kết phosphodieste của bộkhungDNA mạch đôi mà không gây tổn hạiđến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzymenày cắt có thể được nối trở lại bằng loạienzyme khác là các ligases, vì thế các phânđoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắtRE) mà bị cắt từ các nhiễm sắcthể hoặc gene khác nhau có thểđược ghép cùng nhau nếu có trình tự đầudính bổ sung với nhau (xem chi tiết phíadưới). Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹthuật di truyền đều dựa vào các enzyme giớihạn. Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc cácenzyme này được khám phá từ các chủng E.coli mà đang hạn chế sự phát triển của các²thực khuẩn thể. Vì thế enzyme giới hạnđược cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngănchặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ cáctrình tự của virus.Phân loại enzyme giới hạnCác nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạnnói chung thành 3 loại, gọi là Loại I, Loại II vàLoại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tínhphân giải acid nucleic hay phân giải nhómmethyl đều thực hiện chung bởi một phức hợpenzyme lớn. Mặc dù những enzyme thuộc 2loại này cũng nhận biết những trình tự DNAđặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhậnbiết, có khi đến cả trăm base. Chúng cũng cầnATP để hoạt động. Những enzyme này bắtđầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóacủa 2 adenine trong vùng nhận biết. Nếu cảhai adenine đều không được methyl hóa (dấuhiện cho thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợpenzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạttính phân giải. Tuy nhiên, nếu một trong haiadenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNAcủa tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chứcnăng của một enzyme methyl hóa cho gốcadenine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNAbộ gene. Với enzyme giới hạn loại II, chứcnăng phân giải của nó không liên quan đếnchức năng methyl hóa hay phân giải nhómmethyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên tronghay kế cạnh vị trí nhận biết. Ngày nay ngườita biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này vàchúng là một trong những công cụ sinh họcphân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trongcác ứng dụng dòng hóa gene hay phân tíchDNA.Vị trí điểm cắtEnzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đốixứng khi đọc theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA(palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị tríđiểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằmtrong hoặc ngoài trình tự nhận biết này.Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạchđối diện tức thời, tạo ra các đoạn DNA đầubằng (blunt). Hầu hết các en đều tạo ra cácvết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo racác đầu dính. Các enzyme giới hạn có bachức năng quan trọng, mỗi chức năng cắtDNA bằng các cơ chế khác nhau.Đoạn bổ sung và đoạn nốiVì các enzyme giới hạn khác nhau ở các trìnhtự nhận biết và điểm cắt, nên chiều dài vàtrình tự chính xác của đầu dính nhô ra, cũngnhư không biết nó có phải là mạch đầu5 hayđầu 3 mà những phần nhô ra phụ thuộcvào enzyme tạo ra sản xuất ra nó. Tính bổsung giữa những phần nhô ra và các trình tựbổ sung cho phép hai phân đoạn có thể nhậplại với nhau hay splice bởi DNA ligase. Phânđoạn có đầu dính có thể được gắn không chỉvới phân đoan lúc mới bị cắt đầu tiên, mà cònvới bất kỳ phân đoạn nào mà có đầu dínhthích hợp. Kiến thức về điểm cắt cho phép cácnhà sinh học phân tử dự đoán được cách màcác phân đoạn có thể gắn kết và từ đó, có thểchọn ra enzyme thích hợp.]Cách sử dụng See the main article on restriction digests. Các trình tự nhận biết điển hình dài từ 4-12 nucleotide. Do chỉ có một số cách để sắp xếp 4 nucleotide--A, C, G và T-- thành 4 hoặc 8 hoặc 12 trình tự nucleotide, nên các trình tự nhận biết có khuynh hướng crop up bằng cách thay đổi bất kỳ trình tự dài nào. Hơn nữa, RE đặc hiệu với hàng trăm trình tự đã được nhận dạng và tổng hợp để cung cấp cho các phòng thí nghiệm. Kết quả, các điểm giới hạn tiềm ẩn xuất hiện trong hầu hết các gene hoặc nhiễm sắc thể. Trong khi đó, trên các plasmid nhân tạo thường bao gồm đoạn nối linker chứa hàng tá trình tự nhận biết RE bên trong đoạn DNA rất ngắn. Vì thế, dù một gene có được khảo sát dưới dạng nào, gần như người ta luôn luôn có thể tìm ra một hay một vài trình tự nhận biết để xử lý nó bằng enzyme giới hạn nhằm phục vụ cho mục đích dòng hóa. ]Nhiều trình tự nhận biết là palindromicCác trình tự nhận biết rất đa dạng, một sốtrong chúng là palindromic; đó có nghĩa làtrình tự trên một chuỗi đọc theo chiềungược lại với chuỗi bổ sung. Nghĩa củapalindromic trong bài này khác với nhữnggì được mong đợi trong cách sử dụng củanó: GTAATG không phải là trình tự DNApalindromic, mà là GTATAC.Tên gọiEnzym giới hạn được gọi tên dựa vào vikhuẩn mà chúng được phân lập theo cáchdưới đâyE Escherichia (giống)co coli (loài)]Thí dụ minh hoạEnzyme SourceRecognition Sequence CutEcoRI Escherichia coli 5GAATTC5---G AATTC---3 ...