Giải mã trình tự gene mã hóa protein vỏ vi rút vàng xoăn lá cà chua (TYLCV) ở một số tỉnh phía Nam

Nội dung bài viết đề cập trình tự gen protein của virus cà chua lá vàng cà chua (TYLCV) ở một số tỉnh miền Nam Việt Nam. Virus gây bệnh vàng lá (TYLCV) là một trong những bệnh do virus tàn phá nhất ở các vùng trồng trọt ở Việt Nam trong những năm gần đây, và nó có thể gây ra tổn thất thường xuyên lên đến 100%. Trong nhiều vùng, TYLCV là yếu tố hạn chế chính trong sản xuất cà chua. Các tác nhân gây bệnh là một nhóm các loài geminillin thuộc chi Begomovirus thuộc họ geminiviridae, được truyền bởi ruồi trắng (Bemisia tabaci)...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giải mã trình tự gene mã hóa protein vỏ vi rút vàng xoăn lá cà chua (TYLCV) ở một số tỉnh phía NamVIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMGIẢI MÃ TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ VI RÚT VÀNGXOĂN LÁ CÀ CHUA (TYLCV) Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAMNguyễn Ngọc Quỳnh, Lê Thị Thu Hà,Bùi Thị Thu Ngân, Bùi Chí BửuViện KHKT Nông nghiệp miền NamSUMMARYCoat protein gen sequences of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in someSouthern provinces of VietnamTomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is one of the most devastating viral diseases of cultivatedtomato regions in Vietnam in recent years, and it can induce frequent losses of up to 100%. In manyregions, TYLCV is the main limiting factor in tomato production. The causal agents are a group ofgeminivirus species belonging to the genus begomovirus of the family geminiviridae, transmitted bywhitefly (Bemisia tabaci). Coat protein gene of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from tomato leafsamples of Lam Dong and Daklak provinces have been sequenced. The rerults showed that its coatprotein (CP) gene sequences were highly homologous to that of Tomato yellow leaf curl Kanchanaburivirus and Pepper yellow leaf curl Indonesia virus (93%),but it is lowly homologous to that of Tomatoyellow leaf curl virus isolates have been found in the provinces of North Vietnam (88%)Keywords: Coat protein gen, tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Southern.I. ĐẶT VẤN ĐỀ *Bệnh vàng xoăn lá cà chua TYLCV (tomatoyellow leaf curl virus) được xem là bệnh nguyhiểm và gây hại phổ biến ở hầu hết các vùngtrồng cà chua trên thế giới. Bệnh gây lên bởi virút begomovirus có cấu trúc DNA sợi vòng đơn,gồm 6 khung đọc mở, kích thước phân tử 2,72,8 kb. Cây cà chua bị bệnh này có triệu chứngphát triển chậm, còi cọc, lá xoăn vào trong vàhướng lên trên, có thể chuyển vàng, kích thướclá nhỏ lại, số hoa và chùm hoa giảm, trái nhỏ,sượng không chín. Kết quả làm giảm năng suấtvà chất lượng cà chua rõ rệt. Bệnh TYLCV ởnước ta đã phát hiện từ những năm 1970, tới naycác tỉnh phía Bắc đã phân lập được 3 nòi gây hạitrên cà chua là: ToLCVV (Tomato leaf curlVietnam virus), TYLCVNV (Tomato yellowleaf curl Vietnam virus) và PaLCCNV (Papayaleaf curl China virus). Đối với các tỉnh phíaNam mấy năm gần đây bệnh này đã phát triểnthành dịch, gây hai phổ biến trên cà chua tại cácvùng trồng trọng điểm của miền Nam. Tuynhiên cho tới nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứuở mức phân tử về loại bệnh này. Ở miền Nam,cà chua trồng tập trung chủ yếu ở tỉnh LâmNgười phản biện: TS. Nguyễn Công Thành.1018Đồng, với diện tích từ 3,5-4,5 ngàn ha (chiếm30% diện tích cà chua cả nước). Năng suất tráitừ 35-40 tấn /ha, vụ Đông xuân đạt 70-80 tấn/ha.Theo chi cục BVTV Lâm Đồng, năm 2003 diệntích cà chua tỉnh Lâm Đồng bị nhiễm 960 habệnh TYLCV, trong đó 250 ha bị nhiễm nặng,tỷ lệ bệnh trung bình 12.7%, có vùng tỉ lệ nhiễmbệnh tới 90%. Đề tài nghiên cứu giải mã trình tựđoạn gen mã hóa protein vỏ (CP gen) vi rútBegomovirus gây bệnh vàng xoăn lá cà chuatrên địa bàn hai tỉnh Lâm Đồng và Đắk Lắk.Nhằm xác định vi rút gây bệnh vàng xoăn lá càchua ở mức độ phân tử tại vùng nghiên cứu, bổsung vào ngân hàng gen vi rút gây bệnh trên càchua trong nước.II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUCác mẫu lá cà chua có triệu chứng đặc trưngcủa vi rút begomovirus (lá màu vàng, xoăn), thutại các ruộng cà chua của huyện Đơn Dương;huyện Đức Trọng (tỉnh Lâm Đồng) và huyệnEakar (tỉnh Đắk Lắk). Các mẫu lá được bảo quảntrong các túi nylon chứa silicagel và lưu trữ ởnhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng.Ly trích DNA tổng số từ các mẫu lá bằngphương pháp CTAB (Doyle và Doyle,1987): lấy100mg lá tươi (20mg lá khô) chuyển vào ốngeppendorf 1,5 ml và đồng nhất với 500 µLHội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhấtbuffer chứa: 2 M NaCl, 25 mM EDTA, 100 mMTris-HCl, 2% PVP và 2% CTAB bằng chàyinox. DNA tổng số được rửa hai lần vớichloroform: isoamyl alcohol (24:1). Cặn DNAđược rửa 2 lần bằng ethanol 70% và hòa trong50 uL nước cất 2 lần vô trùng. Dịch chiết DNAgiữ ở nhiệt độ -200C.Thiết kế mồi đọc vi rút bằng phần mềmFastPCR và Primer 3. Xác định đoạn gen bảo tồncủa vi rút bằng phần mềm Clustalx2.0.12. Kiểmtra hairpin, dimer, GC%, Tm và nồng độ phảnứng PCR bằng phần mềm IDT. Kiểm tra khảnăng bắt cặp của các mồi bằng phần mềmAnnhyb 4.943. Xác định cặp mồi đặc hiệu bằngcách chạy thử các cặp mồi thiết kế với 3 đốichứng: đối chứng âm TY(-) ly trích DNA từ lácây cà chua gieo từ hạt in vitro; Đối chứng dươngTY(+) lấy từ mẫu DNA của TYLCV đã xác địnhnăm 2009 và H2O nước siêu sạch.Phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA vi rútbằng các cặp mồi đã thiết kế. Thành phần củaphản ứng PCR như sau:Master mix 2X12,5 µlPrimer (F -R)2,0 µlDNA3,5 µlH2O7,0 µlChương trình chạy PCR: Chu kỳ 1: 95oCtrong 5 phút (1 chu kỳ); Chu kỳ 2: 95oC, 30”;37oC ÷60oC, 30”; 72oC, 30” (35 chu kỳ); Chu kỳ3: 72oC trong 6 phút (1 chu kỳ)Chu kỳ 4: 4oC đến ∞Tối ưu qui trình xét nghiệm PCR với cặp ...