Giáo trình Thực hành Hóa sinh học: Phần 2

Tiếp nối phần 1, phần 2 giáo trình "Thực hành Hóa sinh học" trình bày các bài thực hành như: Định lượng axit amin và protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ enzim, định lượng vitamin, định lượng một số nguyên tố kim loại ... Cuốn sách còn được dùng cho thực tập chuyên đề của sinh viên năm thứ tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Giáo trình Thực hành Hóa sinh học: Phần 2 Chương 7 ĐỊNH LUỢNG AXIT AMIN VÀ PROTEIN I. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p CHUẨN đ ộ PORMOL (PHƯƠNG PHÁP SỒRENSEN) 1 . Nguyên tắc Axit amm hoà tan trong nưốc có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và cacboxyl trung hoà lẫn nhau. Nhóm -COO của axit amũi bị cản trỏ bởi các nhóm amin nên không thể chuẩn độ trực tiếp được. Trong fomanđehit, nhóm amin của axit amm phản ứng vổi nhóm anđehit cho metylen, kết quả của phản ứng là nhóm amm mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ. N H ./ o N = CH, I I R — CH HC R — CH H2O I I coo H COOH N=CH2 N = CH2 I R — CH NaOH R — CH HoO I COOH COONa Sô nhóm cacboxyl tự do bằng sô nhóm amm liên kết với íomanđehit, khi chuẩn độ nhóm cacboxyl thì xác định đưđc nhóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được axit amũi có trong dung dịch nghiên cứu. 2. Nguyên liệu Dung dịch axit amin khoảng 0,1% hoặc các nguyên liệu có axit amin cần định lượng. 3. Hoá ch ất - Dung dịch NaOH 0,1 N 72 - Dung dịch HCl 0,1N - Dung dịch fomanđehit tnmg hoà 30%: Lấy 50ml íomanđehit 30% cho thêm o.lml phenolphtalein trong etanol 1 % và chủih bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt. - Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%. - Dung dịch KOH 0,01N trong etanol 90%. - Cồn tuyệt đối - Dung dịch CuCl2 amoniac 0,0025M - Dung dịch phenolphtaleũi 1% trong etanol 60%. 4. Dụng cụ Bình nón, biưet, 2 pipet lOml. 5. Tiến h àn h 1. Cho vào bìiứi nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch phenolphtálẻin ĩ%. 2. Để trung hoà dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt. 3. Cho thêm 20ml dung dịch íomanđehit 30% đã trung hoà và ỉắc đều bình nón. Sau 5 phút dung dịch mất màu. 4. Chuẩn độ bằng NaOH 0,ỈN đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trỏ lại (pH = 9,0). Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tưdng tự vối các hoá chất trên nhưng thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích. 6. Tính k ế t quả Iml dung dịch NaOH 0,1N tưdng đưdng l,4mg nitơ. Sô mg nitđ amin của dung dịch nghiên cứu được tứih theo công thức: mgN = (A - B) X 1,4 Trong đó: A - Sô ml NaOH 0,1N dừng để chuẩn độ bình thí nghiệm, B - Sô ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. Phương pháp chuẩn độ formol các axit amm trực tiếp và thuận lợi. Nó đưỢc sử dụng để định lượng axit amũi trong dung dịch nghiên cứu. Đồng thời cũng cầnnhổ rằng phưđng pháp này không cho kết quả hoàn toàn chửih xác giá trị nitơ amin,vì nếu trong dimg dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fomanđehit nên ỉàm giảm kết quả định lượng. Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có tữozin, nó lại làm tăng kết quả định lượng vì nó có nhóm phenol. Phưdng pháp định lượng bằng chuẩn độ íormol 73 không thể sử dụng vối mẫu có muối amoni, vì formalm sẽ cho hexamm, đồng thời giải phóng ra axỉt. 4NH^C1 + 6HCH0 > N4(CH2)g + 6 H 2O + 4HC1 Nhóm cacboxyl của các axit amin lưõng tính, các peptit lỏn và protein có thể đưỢc xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ trong dung dịch nước - etanol không có formalũi. Môi trưồng nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm atnin, kết quả là nó trơ trong môi trường nước, axit amm trồ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amữi có thể được chuẩn độ lại bằng kiềm. Với đặc tính cđ bản này, có thể định lượng axit amin bằng phưdng pháp micro: Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tymolphtalem 0,1% trong etanoỉ 90% và chuẩn độ bằng KOH 0,0 IN trong etanol 90% đến khi xuất hiện màu xanh. Sau đó cho thêm 10 thể tích cồn tuyệt đôi vào 1 thể tích dung dịch cần định ỉượng axit amm. Màu dung dịch biến mất, chuẩn độ lại dung dịch cho đến màu xanh. Mầu để so sánh vối màu chuẩn độ có thể sử dụng dung dịch amoniac CuClg 0.0025M . Phương pháp này đặc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzim, biểu diễn dưối ảnh hưỏng tác động lên các enzim proteolitic protein và peptit. II. Đ ỊN H L Ư Ợ N G A X IT A M IN B Ằ N G N IN H IĐ R IN 1. N ^ y ê n tắc Dưới tác dụng của ninhiđrũi, axit amin bị oxi hoá chuyển thành axit amm rồi đến amoniac và cacbonic. Axit amin bị giảm bốt 1 nguyên tử cacbon, nó trỏ thành dạng anđ ...