GIÁO TRÌNH : THỰC TẬP SINH HÓA part 6

Đun sôi hổn hợp trong ống sinh hàn trong 10 giờ. Dung dịch trở thành màu vàng hay xanh lá cây thẫm. Tiếp tục cho thêm: + Liti sulphate LiSO4: 150g + Brom: 5 giọt + Nước cất: 50mL Đun sôi trong 15 phút. Dung dịch thu được có màu vàng sáng. Nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với brom lần thứ hai. Sau khi làm nguội thêm nước cất đến 1 lít. Xác định lại nồng độ thuốc thử Folin bằng cách chuẩn độ với NaOH 1N với chỉ thị phenolphtalein. Chứa dung dịch trong...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
GIÁO TRÌNH : THỰC TẬP SINH HÓA part 6 Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa Đun sôi hổn hợp trong ống sinh hàn trong 10 giờ. Dung dịch trở thành màu vàng hay xanh lá cây thẫm. Tiếp tục cho thêm: + Liti sulphate LiSO4: 150g + Brom: 5 giọt + Nước cất: 50mL Đun sôi trong 15 phút. Dung dịch thu được có màu vàng sáng. Nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với brom lần thứ hai. Sau khi làm nguội thêm nước cất đến 1 lít. Xác định lại nồng độ thuốc thử Folin bằng cách chuẩn độ với NaOH 1N với chỉ thị phenolphtalein. Chứa dung dịch trong chai nâu, bảo quản trong tủ lạnh. Tiến hành a. Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ 0 – 200 µg/mL từ dung dịch protein gốc (BSA 200 µg/mL), sau đó cho thêm các hoá chất vào 6 ống nghiệm theo bảng sau: 1 2 3 4 5 6 Ống nghiệm Nồng độ dung dịch (µg/mL) 0 40 80 120 160 200 Thể tích dd protein chuẩn (µL) 0 100 200 300 400 500 Thể tích dd NaCl 0,9% (µL) 500 400 300 200 100 0 Thể tích dung dịch C (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Thuốc thử Folin (µL) 250 250 250 250 250 250 b. Chuẩn bị dung dịch phân tích: Cho vào ống nghiệm: - 1000 µL dd dung dịch phân tích (Tính toán sao cho nồng độ protein trong dung dịch từ 20 –200 µg/mL) - 4 mL dung dịch C - 0,5 mL thuốc thử Folin Sau khi chuẩn bị các dung dịch trên, lắc đều, để yên trong 30. Quan sát dãy dung dịch và đo độ hấp thụ ở bước sóng 750 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn. Từ giá trị độ hấp thụ của dung dịch phân tích, có thể suy ra nồng độ protein trong mẫu phân tích dựa vào đường chuẩn. 5.6. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Nguyên tắc Khi đun sôi lâu mẫu vật có chứa nitrogen (đạm) trong H2SO4 đậm đặc với sự hiện diện của chất xúc tác thích hợp thì tất cả các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa còn NH3 được giải phóng ra liên kết với H2SO4 tạo thành (NH)2SO4. 46 Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa H2SO4 ââ (NH4)2SO4 Xuïc taïc, tO Hợp chất chứa N Ta có thể xác định lượng đạm này khi cho chúng tác dụng với NaOH, chúng sẽ được lôi cuốn bằng hơi nước và được cất qua bình hứng có chứa dung dịch acid sulfuaric ( H2SO4) hay acid boric và hỗn hợp thuốc thử. (NH4)2SO4 + 2 NaOH = 2 NH4OH + Na2SO4 to NH3 + H2 O NH4OH NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Hoặc NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 Sau đó định lượng amoni tetraborate tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,005N theo phản ứng sau : (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Hóa chất và dụng cụ * Dụng cụ - Máy cất đạm bán tự động Gerhardt - Hệ thống vô cơ hóa Gerhardt - Bình Kjeldahl 250 mL - Các dụng cụ thủy tinh thông thường trong phòng thí nghiệm * Hóa chất - Dung dịch NaOH 10% - K2SO4 - Dung dịch H2SO4 0.01 N - CuSO4 - Dung dịch acid boric 2% - Selenium - H2SO4 đậm đặc - Dung dịch bromoncresol green và methyl đỏ trong alcol Tiến hành a. Sự vô cơ hóa Cân chính xác 1 gam mẫu vật đã nghiền nhuyễn hay 1 mL (nếu mẫu vật ở dạng dung dịch), chuyển mẫu vật đã cân vào bình Kjeldahl có thể tích 50-100mL, sau đó thêm 5 mL H2SO4 đậm đặc. Để rút ngắn thời gian vô cơ hóa, ta thêm vào bình một lượng chất xúc tác cần thiết là 0,5 gam. Hỗn hợp chất xúc tác này gồm K2SO4: CuSO4: Se (100:10:1). Sau khi cho chất xúc tác vào bình, đem đun sôi trong máy vô cơ hóa Gerhardt đã được nối với hệ thống hấp thu khí độc cho đến khi dung dịch trong bình Kjeldahl trong suốt. Để nguội, ta kiểm tra kết thúc sự vô cơ hóa bằng cách cho vào bình một lượng nhỏ nước cất (thường bằng bình tia) rồi lắc nhẹ tráng thành bình, thấy không còn những hạt mụi đen li ti là được. Nếu còn ta phải đun tiếp tục cho đến hết. 47 Giáo Trình Thực Tập Sinh Hóa Lưu ý: Khi vô cơ hóa ta cần thực hiện với 3 bình thử thật (có mẫu vật) và 3 bình thử không (không có mẫu vật). b. Cất đạm Sau khi vô cơ hóa kết thúc, mẫu được đem cất đạm trong máy cất bán tự động Gerhardt. Chuẩn bị máy: cắm điện, bật máy, màn hình sẽ hiện lên chữ “H”, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi màn hình hiện chữ “P”, máy đã sẵn sàng làm việc. Cho 20 mL acid boric 2% vào bình tam giác 100 mL, thêm 2 giọt thuốc thử, lắp vào vị trí hứng mẫu trên máy. Chú ...