Hóa Enzyme - Phân Tích Phân Tử Enzyme Phần 6

Muốn thăm dò, phát hiện và xác định các nhóm chức năng của phân tử enzyme, người ta thường dùng các phương pháp vật lý, hóa học, xác định hằng số ion hóa của các nhóm chức năng và tốt nhất là kết hợp với việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme và của trung tâm hoạt động.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Hóa Enzyme - Phân Tích Phân Tử Enzyme Phần 6 58hoạt động của enzyme, bởi vì có nhiều nhóm chức năng chỉ làm nhiệm vụduy trì cấu trúc không gian hoạt động cho phân tử enzyme. Muốn thăm dò, phát hiện và xác định các nhóm chức năng của phântử enzyme, người ta thường dùng các phương pháp vật lý, hóa học, xácđịnh hằng số ion hóa của các nhóm chức năng và tốt nhất là kết hợp với việcnghiên cứu cấu trúc phân tử của enzyme và của trung tâm hoạt động. Các phương pháp vật lý có khả nưng phá huỷ một cách đặc hiệu cácnhóm chức năng của enzyme thường không nhiều, vì khó có thể chọnđược các tác nhân chỉ phá huỷ một số nhóm hóa học nhất định mà lạikhông làm ảnh hưởng đến toàn bộ cấu trúc của phân tử enzyme. Chính vìvậy, thông thường người ta khóa, phá huỷ, hoặc đánh dấu các nhóm chứcnăng đó bằng các thuốc thử hóa học như chất ức chế đặc hiệu, cơ chấthoặc coenzyme .4.5.1. Phương pháp dùng chất ức chế Tùy trường hợp có thể dùng các chất ức chế đặc hiệu khác nhau, ví dụ: - Đối với một số enzyme oxy hóa khử có nhóm hoạt động là ion sắtngười ta dùng xyanua (cyanide CN) để phát hiện vai trò của ion sắt đối vớihoạt tính của enzyme vì CN kết hợp với ion sắt làm cho enzyme mất khảnăng vận chuyển điện tử. Ví dụ CN ức chế enzyme cytochromoxydase. - Một số enzyme cần có ion kim loại tham gia vào quá trình xúc táchoặc để giữ ổn định cấu trúc phân tử enzyme. Để thăm dò phát hiện đặctính cần kim loại của chúng, người ta dùng chất kết hợp kim loại nhưEDTA (Ethylen diamino tetraacetate) hoặc orthophenantrolin... Nếu làenzyme cần kim loại thì sẽ mất hoạt tính. - Để thăm dò vai trò nhóm - S - CH 3 của methionine đối với hoạttính của enzyme thì oxy hóa nhóm này thành sunfoxit tương ứng: - S - CH3và enzyme sẽ mất khả năng xúc tác. O - Vai trò của nhóm - SH của Cysteine đối với hoạt động của enzymeđược xác định bằng cách cho phản ứng với muối kim loại nặng hoặc dẫnchất của chúng ví dụ PCMB (parachloromercuri - benzoate) hoặc chophản ứng với iodoacetate. Dưới tác dụng của các chất đã nêu, nhóm SH của enzyme sẽ bị khóavà enzyme mất hoạt động. - Để phát hiện nhóm imidazol của Histidine đối với hoạt tính củaenzyme người ta phá huỷ nhóm này bằng phương pháp oxy hóa quang học 59với sự có mặt của xanh metylen hoặc cho phản ứng với iodoacetate. Khinhóm chức này bị phá huỷ hoặc bị khóa thì enzyme đều mất hoạt tính. - Để tìm hiểu vai trò của nhóm ε - NH2 của lysine có thể cho phảnứng với fluordinitro benzen (FDNB) để tạo thành dinitrophenyl (DNP)màu vàng. FDNB phản ứng với các nhánh bên của amino acid khác nhưimidazol, phenol, thiol thì tạo ra dẫn chất DNP không màu. Cũng có thể ức chế nhóm ε - NH2 bằng cách cho phản ứng vớinhững yếu tố oxy hóa. - Vai trò của nhóm - OH của serine đối với hoạt tính của enzymeđược thăm dò bằng cách cho tác dụng với chất ức chế đặc hiệu làdiisopropylfluor-phosphate (DFP). DFP sẽ khóa nhóm - OH của serine vàenzyme mất hoạt tính. Trong một số trường hợp các nhóm chức năng tham gia vào cơ chếxúc tác có thể được phát hiện dễ dàng hơn so với các nhóm hóa học kháccùng loại, đó là nhờ khả năng phản ứng đã tăng lên do vị trí đặc biệt củachúng trong phân tử enzyme.4.5.2. Phương pháp đánh dấu bằng cơ chất đặc hiệu hoặc coenzyme - Nhiều người cho rằng dùng cơ chất đặc hiệu để đánh dấu các nhómchức năng là hợp lý nhất song cũng gặp nhiều khó khăn và phức hợp đượctạo thành thường không vững bền (phức hợp enzyme - cơ chất dễ dàng bịphân ly ngược chiều, phức hợp enzyme - sản phẩm của phản ứng cũngphân ly với tốc độ cao). Tuy vậy, bằng phương pháp thực nghiệm khônkhéo người ta đã tách được các sản phẩm trung gian của phản ứng kết hợpvới enzyme bằng liên kết đồng hóa trị vững bền. Ví dụ như người ta đãtách được phosphoserine đánh dấu trong trường hợp củaphosphoglucosemutase ở quá trình phản ứng vận chuyển phosphore, hoặcphức hợp enzyme với sản phẩm trung gian của triosephosphatedehydrogenase. - Phương pháp đánh dấu bằng coenzyme cũng được sử dụng và cógiá trị trong một số trường hợp. Như người ta đã nghiên cứu trung tâmhoạt động của cytochrome C bằng cách dùng coenzyme heme làm chấtđánh dấu cũng như dùng pyridoxal phosphate làm chất đánh dấu để nghiêncứu một số enzyme cần coenzyme này làm yếu tố phối hợp. Cần lưu ý là chỉ có thể dùng coenzyme, cơ chất hay chất giống cơchất để đánh dấu những nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động củaenzyme khi nào liên kết hóa học giữa chất đánh dấu với những nhóm này 60đủ vững bền hoặc được biến thành những liên kết vững bền bằng phươngpháp thích hợp. Mặt khác, khi cơ chất hoặc coenzyme kết hợp với enzymeđã làm cho enzyme không bị ức chế bởi các thuốc thử đặc hiệu ...