Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) được hiểu là sự đadạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzimgiới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đạiPCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos vàcộng sự năm 1995.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLPI. Giới thiệuKỹ thuật AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) được hiểu là sự đadạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzimgiới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đạiPCR. AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA được phát triển bởi Vos vàcộng sự năm 1995. Kỹ thuật này là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều locicủa đa hình DNA mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA củachúng (Michelmore và ctv., 1998), phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóngmột ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau(Breyen và ctv., 1997; Cervera và ctv.,1996)II. Nguyên tắcNguyên tắc của phương pháp AFLP cũng giống như RFLP, điểm khác biệt cơbản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot ), do vậy thựchiện nhanh hơn. Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là: - Cắt DNA bằng enzim giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nêncác đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước. Cặp enzymethường được dùng nhất là EcoRI - MseI. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phầntrình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. - Khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồikhác nhau. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptorvà chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạnDNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đượckhuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩmPCR và làm đơn giản quá trình phân tích.II. Kỹ thuật AFLP1. Qui trìnhQui trình thực hiện AFLP gồm bốn bước:Bước 1: DigestionDùng 2 enzim giới hạn EcoRI (ít có = 4096 bases) có trình tự nhận biết 6 base vàMseI (thường có = 256 bases) có trình tự nhận biết 4 base, cắt DNA khuôn thànhnhững phân đoạn. Hai enzym giới hạn này được dùng để sắp xếp lại DNA nhờkết hợp với 2 adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA không trở lại hình dạng banđầuVị trí cắt của enzimEcoRI = 5’-G AATT C-3’ 3’-C TTAA G-5’MseI = 5’-T TA A-3’ 3’-A AT T-5’Bước 2 : LigationNối với EcoRI adaptor và MseI adaptor, là những oligonucleotide sợi đôi gắn vào2 đầu phân đoạn DNA. Cấu trúc của 2 adaptor như sau :EcoRI-adaptor5-CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5MseI-adaptor5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5Bước 3 : Tiền khuếch đại- Chạy PCR với các mồi (primer) chọn lọc, các mồi này được cấu tạo gồm 3phần : trình tự nồng cốt (CORE) + trình tự theo enzim (ENZ) + trình tự chọn lọc(EXT) (theo định hướng của người nghiên cứu ký hiệu là NNN, có thể là TGAhoặc AAC hoặc CTG...)Nhờ vậy, chỉ những phân đoạn có nu bổ sung được với nu chọn lọc được nhânlên. Sự khuếch đại chọn lọc như vậy làm giảm số lượng phân đoạn hàng ngànlần. Chỉ những đoạn DNA ngắn có một đầu là primer MseI và một đầu là primerEcoRI là được khuếch đại đáng kể, các đoạn có hai đầu là EcoRI bị mất đi do sốlượng ít và hai đầu là MseI tự tạo thành vòng nhỏ DNA do cạnh tranh với primer.Sản phẩm tiền phản ứng được pha loãng và được dùng làm vật liệu để khuếchđại với đoạn mồi chọn lọc màu huỳnh quang.Bước 4 : Khuếch đạiSản phẩm PCR của bước tiền khuếch đại được dùng làm khuôn cho bướckhuếch đại sau đó, sử dụng primer có gắn 3 nu chọn lọc ở đầu 3’ và chỉ EcoRIprimer được đánh dấu huỳnh quang ở đầu 5’. Vì vậy, chỉ những sợi chứa EcoRIđược phát hiện trên máy ABI 310. PCR được xảy ra với thông số miêu tả bởiCervera và ctv (1996). Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo chomồi chọn lọc. Nhiệt độ này giảm dần sẽ làm tăng sự kết hợp. Sử dụng primergắn với 3 nu chọn lọc sẽ giúp hạn chế việc bắt cặp sai (mismatch), chỉ nhân lênmột số lượng lớn những băng chuyên biệt.Ngoài ra, việc khuếch đại qua 2 bước có những thuận lợi hơn khuếch đạitrực tiếp như:- Phổ diện rõ hơn vì không có quá nhiều loại marker.- Qua bước tiền khuếch đại, tạo lượng lớn DNA khuôn cho sự khuếch đại dễdàng và hiệu quả hơn.- Sau khi xong phản ứng, mẫu được biến tính bằng cách thêm một lượng tươngđương thể tích 15µl dung dịch đệm Formamide và đun nóng 5’ ở 95oC. 1ml mỗimẫu được nạp tự động vào ống mao quản (capilary) polymer ABI 310. Hình : các bước thực hiện kỹ thuật AFLP2. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật AFLPƯu điểm của kỹ thuật AFLP- AFLP không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen.- Có tính lặp lại cao hơn RAPD và chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban đầu(2.5pg-25ng)- Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình (polymorphism)trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa các quần thểcó quan hệ gần nhau.- Không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, không cần sửdụng nhiều loại primer.- Là kỹ thuật in dấu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể in dấuDNA của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thực vật, độngvật đến con người.Nhược điểm- Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cáthể đồng hợp và dị hợp.- Qui trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện.- Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diện các phânđoạn DNA lý tưởng.III. Ứng dụng- In dấu DNA, lập bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những markerkhác (Vos và ctv., 1995).- Tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống.- Đánh giá mức độ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống.- Là công cụ hiệu quả để phát hiện tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết sựkhác biệt giữa các cá thể. • Travis và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật AFLP để đánh gía sự đa dạng di truyền giữa tất cả những quần thể của Astragalus cremnophylax . Chín loại mồi đã được sử dụng để cho ra 325 vạch của 143 cá thể được thu mẫu từ ba quần thể. Từ kết quả phân tích được, Travis và cộng tác viên (1996) có thể biểu thị đặc điểm của sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của chúng và đưa ra ...