KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 7

Hình 11: Kết quả giải trình gen trên máy tự động.Thông tin được ghi và lưu lại dưới dạng các băng DNA có màu huỳnh quang khác nhau, dưới dạng sóng và trình tự nucleotide.5) Sau khi chuẩn bị gel, kiểm tra kết nối máy điện di với máy vi tính, thiết định protocol và thư mục về mẫu rồi điện di tiền khởi để kiểm tra độ sạch của bản gel (chủ yếu là bề ngoài tấm thủy tinh vùng quỹ đạo của đầu dò đọc huỳnh quang, nếu chưa sạch phải lau lại bằng isopropyl alcohol). 6) Xử...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 7 107pipet hoặc đổ bỏ cũng được), tráng nhẹ tủa bằng 250 µl ethanol 75% rồiloại bỏ hoàn toàn lớp ethanol (tránh quấy vào tủa không thể nhìn thấy),làm khô. Hình 11: Kết quả giải trình gen trên máy tự động. Thông tin được ghi và lưu lại dưới dạng các băng DNA có màu huỳnh quang khác nhau, dưới dạng sóng và trình tự nucleotide.5) Sau khi chuẩn bị gel, kiểm tra kết nối máy điện di với máy vi tính, thiếtđịnh protocol và thư mục về mẫu rồi điện di tiền khởi để kiểm tra độ sạchcủa bản gel (chủ yếu là bề ngoài tấm thủy tinh vùng quỹ đạo của đầu dòđọc huỳnh quang, nếu chưa sạch phải lau lại bằng isopropyl alcohol).6) Xử lý dịch màu trộn formamide (chuẩn bị trước dung dịch loading 10 8buffer bằng cách trộn formamide khử ion và EDTE (pH 8,0) 25mM chứavới tỷ lệ formamide:EDTA-Blue dextran là 5:1). Cho vào ống chứa sảnphẩm phản ứng sạch nêu trên 4 - 6 μl dịch màu formamide, trộn xoáy và litâm tập trung.7) Xử lý nhiệt (đưa vào nước sôi 1 phút rồi đưa nhanh về nước đá đang tancho đến khi tải mẫu).8) Tải vào gel polyacrylamide-urea đã ráp trong máy Sequencer tự độngnhư trình bày ở trên. Thể tích mẫu cần tải thường là 4 - 6 μl. Kiểm tra chếđộ đọc và lưu thông tin trên máy tính kết nối với máy Sequencer. Chú ý,trong nhiều trường hợp tải mẫu ở các giếng gel kế tiếp nhau có thể dẫn đếnhiện tượng nhiễu thông tin do có sự giao thoa giữa các làn kề nhau, khi đótải gel cách giếng làm giảm hiện tượng này. Nếu cần tải tất cả các giếng thìnên tải hai lần. Lần đầu tải dịch phản ứng vào các lỗ giếng cách khoảng,điện di 10 phút rồi tắt máy (mở nắp thì máy tự động dừng) và tải mẫu vàocác giếng xen kẽ còn lại.9) Cho máy chạy 10 giờ (qua đêm). Các thiết bị Sequencer tự động sẽ tựđộng dò đọc sự dịch chuyển của các đoạn DNA trong gel một cách định kỳ(một số lần trong 1 phút, tùy thiết kế) trên một lộ tuyến cắt ngang đườngdịch chuyển của DNA và lưu giữ thông tin cho việc phân tích kết quả(cũng như biên tập (edit) kết quả) trên máy vi tính. Với cách kiểm tra thựcthời này thì các mảnh DNA có khối lượng phân tử càng nhỏ thì càng pháthiện sớm và lần lượt đến phát hiện phân tử có khối lượng lớn hơn.2. Phương pháp Maxam-Gilbert Phương pháp Maxam-Gilbert thực hiện đánh dấu hóa học từngphần đặc hiệu với bốn loại nucleotide (A, T, G và C). Sau đó, cắt phân tửDNA này một cách đặc hiệu tại vị trí đã đánh dấu. Cuối cùng, điện di sảnphẩm phân giải DNA thu được trong gel polyacrylamide. Di động của cácđoạn DNA trong điện trường phụ thuộc vào độ dài của chúng, nhờ đó xácđịnh được trình tự nucleotide. Phương pháp này hầu như không còn đượcsử dụng mô tả ở đây với mục đích tham khảo.1) Dùng polynucleotide kinase đánh dấu đầu 5 hoặc dùng enzyme Klenowđánh dấu đầu 3 của DNA bằng [32P], sau đó dùng enzyme hạn chế để cắthoặc phân li bằng cách tách sợi (strand separation), điều chế các đoạnDNA đánh dấu một sợi.2) Hòa tan [32P]DNA trong 20 µl nước cất, thêm 5 µl DNA (1 mg/ml) tinhdịch cá hồi. 1093) Chia dịch DNA nêu trên ra 5 ống Eppendorf mỗi ống 5 µl.4) Các mẫu được tiến hành đánh dấu hóa học của 5 loại base như nêu dướiđây.2.1. Đánh dấu hóa học2.1.1. G1) Thêm 200 µl dung dịch đệm DMS, làm lạnh ở trong nước đá. Dung dịch đệm DMS (DMS buffer solution) chứa 50 M sodium cacodylate (pH 8,0) và 1 mM EDTA.2) Thêm 1 µl DMS (dimethylsulfate), cho phản ứng 1 phút ở 20 ºC.3) Thêm 50 µl dịch dừng DMS và 70 µl ethanol đã làm lạnh, trộn xoáymạnh, để ở −70 ºC trong 15 phút. Dịch dừng DMS (DMS stop solution) chứa sodium citrate 1,5M (pH 7,5), 2-mercaptoethanol 1,0M và tRNA 100 µg/ml.4) Quay li tâm 10 phút, lấy tủa, hòa tan tủa trong 250 µl sodium citrate0,3M.5) Thêm 750 µl ethanol đã làm lạnh, trộn đều và để 15 phút ở −70 ºC.6) Quay li tâm 10 phút, tráng tủa 2 lần trong ethanol 70%.7) Làm khô bằng máy hút chân không.2.1.2. A>C1) Thêm 100 µl dung dịch NaOH 1,2N - EDTA 1mM, cho phản ứng trong4 phút ở 90 ºC.2) Thêm 150 µl acetic acid, 5 µl tRNA (1 mg/ml) và 750 µl ethanol 70%đã làm lạnh, trộn kỹ, để ở −70 ºC trong 15 phút.3) Quay li tâm 10 phút, lấy tủa, hòa tan tủa trong 250 µl sodium citrate0,3M.4) Thêm 750 µl ethanol đã làm lạnh, trộn đều và để 15 phút ở −70 ºC.5) Quay li tâm 10 phút, tráng tủa 2 lần trong ethanol 70%.6) Làm khô bằng máy hút chân không.2.1.3. G+A1) Thêm 15 µl nước cất và 2 µl formic acid pH 2,0 (điều chỉnh pH bằng 110piperidine, một dung môi hữu cơ có tính kiềm), phản ứng 1 giờ ở 20 ºC.2) Làm đông khô.3) Hòa tan DNA trong 20 µl nước cất.4) Lại làm đông khô.2.1.4. T+C1) Thêm 20 µl nước cất, làm lạnh ở 0 ºC.2) Thêm 25 µl hydrazine (HZ), phản ứn ...