KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 8

Để cho phản ứng ở 60 ºC trong 10 phút. 9) Sau phản ứng,chuyển dịch phản ứng (khoảng 1 ml) sang ống loại 10 ml. Thêm vào chai scintilation 0,5 ml dung dịch rửa, xử lý 10 phút ở 65 ºC. Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lý dung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1,5 ml. Dung dịch rửa chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, SDS 1% và EDTA 5mM. 10) Thêm 40 µg proteinase K (nồng độ cuối cùng 25 µg/ml), cho phản ứng xảy ra...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 8 125ứng là 15mM và 1%). Để cho phản ứng ở 60 ºC trong 10 phút.9) Sau phản ứng,chuyển dịch phản ứng (khoảng 1 ml) sang ống loại 10 ml.Thêm vào chai scintilation 0,5 ml dung dịch rửa, xử lý 10 phút ở 65 ºC.Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lýdung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1,5 ml. Dung dịch rửa chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, SDS 1% và EDTA 5mM.10) Thêm 40 µg proteinase K (nồng độ cuối cùng 25 µg/ml), cho phản ứngxảy ra ở 37 ºC trong 30 phút.11) Thêm dung dịch NaCl vào dịch phản ứng cho đạt nồng độ 0,1M và 2,5lần thể tích ethanol, để 10 phút ở −80 ºC cho kết tủa. Quay li tâm 10.000v/ph trong 10 phút thu tủa sản phẩm. Hòa tủa này trong 50 µl TE. TE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM và EDTA 2mM.4. Hybridization1) Ngâm màng đã thẩm đốm DNA plasmid (bước 2.) vào dung dịch run-on assay prehybridization (1 ml cho một màng có diện tích khoảng 20cm2) trong 4 - 16 giờ ở 42 ºC. Dung dịch run-on assay prehybridization (dịch lai tiền khởi cho run-on assay) chứa formamide ở nồng độ 50%, sodium phosphate (pH 6,5) 50mM, SSC 5× (25 ml SSC 20× trong 100 ml), DNA tinh dịch cá hồi biến tính 250 µg/ml và Denhardt 1× (10 ml dung dịch Denhardt 10× trong 100 ml).2) Thay bằng dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai). Tiến hànhlai trong 48 giờ ở 42 ºC. Dung dịch run-on assay hybridization (dịch lai cho run- on assay) chứa 4 phần dịch run-on assay prehybridization và 1 phần dung dịch dextran sulfate 50%.3) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% ba lần ởnhiệt độ phòng mỗi lần 5 phút.4) Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2× và SDS 0,1% hai lần ởnhiệt độ 65 ºC mỗi lần 15 phút.5) Hong khô, gói trong giấy nhựa mỏng (Saran wrap), thực hiện tự kýphóng xạ.6) Đọc kết quả dựa vào độ đậm nhạt trên film X-quang. Quá trình phiên 126mã của một hệ phiên mã in vitro (sau khi phá tế bào) nếu tiếp tục diễn ra sẽtổng hợp RNA có chứa [α-32P]UTP, vì vậy đốm (blot) tương ứng sẽ chokết quả phóng xạ dương tính. Run-on assay như vậy chỉ cho ta thấy hệ nàođược cảm ứng phiên mã (bởi hóa chất cảm ứng nào đó, chẳng hạn) tại thờiđiểm đình chỉ nuôi cấy tế bào. 127VII. Phân tích xê dịch gel (gel shift analysis) DNA có cấu trúc chuỗi thẳng đơn điệu. Tuy vậy, thành phần đơnđiệu đó cũng có những vùng đặc biệt có cấu trúc không gian xác định nêncó những thuộc tính riêng. Những cấu trúc đó thường kết hợp một cách đặchiệu với các protein nhất định dẫn đến những cơ cấu chức phận nhất định.Để tìm hiểu những cấu trúc đặc biệt đó của DNA người ta phân tíchprotein kết hợp DNA. Một trong những phương pháp phân tích protein kết hợp DNA hữuhiệu là phân tích xê dịch gel (gel shift analysis). Phương pháp này dựa trênhiện tượng nếu trộn DNA với protein thì khi điện di trong gelpolyacrylamide dưới điều kiện cường độ ion thấp thì các đoạn DNA kếthợp protein sẽ dịch chuyển trong gel chậm hơn so với những đoạn DNAkhông kết hợp protein. Nhờ phương pháp này người ta có thể thực hiệnphân tích được các protein liên quan đến điều tiết thể hiện gen.1) Chế tác gel: Pha 5 ml dung dịch acrylamide 40%, 0,5 ml ammoniumpersulfate 10% với 5 ml dung dịch đệm gel shift 10×, thêm nước cất chođủ tổng lượng là 50 ml. Sau khi chuẩn bị xong khuôn gel, thêm 10 µlTEMED, trộn đều (đừng để tạo bọt) rồi rót khuôn để chế tác bản gel. Dung dịch acrylamide 40% chứa 39 g acrylamide và 1 g N,N-methylene-bis-acrylamide hòa tan trong 100 ml nước cất. Dung dịch đệm gel shift 10× chứa Tris-HCl (pH 7,9) 67mM, EDTA 10mM và sodium acetate 33mM.2) Thực hiện điện di chuẩn bị trong dung dịch đệm gel shift 10× (20 mA, 2giờ). Trong quá trình điện di cần dùng bơm nhu động để tuần hoàn dungdịch điện di cho hai điện cực để làm hạn chế sự thay đổi pH dung dịch vàtránh làm nóng bản gel.3) Chế tác dịch DNA-protein theo cách sau: -Cho 1 - 4 µl dịch chiết xuất nhân (khoảng 5 mg/ml) (xem tiếttrước) vào một ống Eppendorf. -Thêm vào chiết xuất nhân một lượng dung dịch đệm D cho đủtổng lượng là 12 µl. Dung dịch đệm D chứa HEPES-KOH (pH 7,9) 20mM, KCl 100mM, glycerol 20%, DTT 0,5mM và PMSF 0,5mM. 128 -Thêm MgCl2 10mM và spermidine 125mM mỗi loại 2 µl. -Thêm 3 µl poly(dI-dC).poly(dI-dC) (1mg/ml) trộn đều, để 2 - 3phút ở nhiệt độ phòng. -Thêm 1 µl (1 ng/ml) đoạn DNA đã đánh dấu [32P] (khoảng 5.000 -10.000 cpm) (đánh dấu đầu 5 hay đầu 3 đều được).4) Ủ dịch phản ứng ở 30 ºC trong 30 phút, sau đó tải dịch phản ứng vào gelđã qua bước điện di chuẩn bị, điện di với dòng điện 30 mA. Chú ý chỉ ápdụng dung dịch màu tải mẫu đối với mẫu không áp dụng phản ứng DNA-protein.5) Điện di kết thúc khi DNA tiến gần mép cuối của bản gel (BPB của dịchmàu chỉ vị trí của đoạn DNA dài khoảng 60 base trong bản gel điện di).6) Sau khi điện di, chuyển gel sang giấy thấm Whatman 3MM, làm khôbằng chân không có kết hợp gia nhiệt (đến 80 °C).7) Thực hiện tự ký phóng xạ. 129VIII. Thí nghiệm cản trở kết hợp methyl hóa dimethylsulfate (DMS) Thí nghiệm cản trở kết hợp methyl hóa dimethyl sulfate (DMS) làphương pháp xác định guanine nucleotide liên quan trực tiếp đến sự kếthợp của DNA với protein. Phương pháp này sử dụng mẫu dò (probe)methyl hóa từng phần trong phân tích gel shift, nhưng những mẫu dò có vịtrí kết hợp protein đã methyl hóa thì không thể hình thành thể phức hợpvới protein cho nên đối với những mẫu dò đã chuyển dịch thì phản ứng cắtnucleotide ở ...