KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 9

XIII. Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạoĐể phân tích và xác định các miền cơ năng trong phân tử DNA như promoter, enhancer... cũng như các miền cơ năng trong phân tử protein (trung tâm hoạt động của enzyme...) người ta phải chế tác một cách có chủ định và di nhập các biến dị nhân tạo vào các DNA đã được clone hóa. Phương pháp tạo thể biến dị nhân tạo có thể bao gồm việc chế tác thể đột biến khuyết tổn (deletion mutant) và chế tác thể đột biến điểm (point mutant). 1. Chế tác...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 9 143XIII. Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo Để phân tích và xác định các miền cơ năng trong phân tử DNA nhưpromoter, enhancer... cũng như các miền cơ năng trong phân tử protein(trung tâm hoạt động của enzyme...) người ta phải chế tác một cách có chủđịnh và di nhập các biến dị nhân tạo vào các DNA đã được clone hóa.Phương pháp tạo thể biến dị nhân tạo có thể bao gồm việc chế tác thể độtbiến khuyết tổn (deletion mutant) và chế tác thể đột biến điểm (pointmutant).1. Chế tác thể đột biến khuyết tổn Có thể dùng exonuclease Bal 31 trong chế tác một loạt thể biến dịkhuyết tổn có phương hướng từ đầu phân tử DNA. Enzyme này tiêu hóadần DNA với vận tốc khoảng 50 bp/phút. Vì vậy tùy thời gian ủ mà ta cósản phẩm thu được dài hay ngắn. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Hình 13: Một trường hợp xử lý DNA bằng enzyme Bal 31. DNA bị cắt ngắn dần phụ thuộc thời gian xử lý, lần lượt các làn từ trái sang phải: sau xử lý 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 phút. Vấn đề quan trọng là ở chỗ làm thế nào để có thể tiêu hóa đoạnDNA xác định từ một hướng. Để thực hiện được việc này người ta clonehóa DNA xác định vào plasmid bằng hai enzyme hạn chế khác nhau,chẳng hạn A và B, (ta có plasmid mạch vòng), sau đó dùng một trong haienzyme hạn chế này (chẳng hạn enzyme A) cắt plasmid tại điểm nối (làmplasmid tổ hợp có mạch thẳng). Từ điểm nối này nếu cho DNA phản ứngvới Bal 31 thì một đầu của DNA đã định đó và một đầu tự do của plasmid 144bị cắt cụt dần. Sau khi cắt bằng Bal 31, người ta dùng enzyme Klenow làmbằng đầu DNA rồi dùng linker kết nối các đầu để có chỗ cho enzyme hạnchế hoạt động, khi đó xử lý lại bằng enzyme hạn chế A sẽ tạo được đầudính. Đến đây dùng enzyme B cắt tiếp để đoạn còn lại của DNA đích đứtkhỏi đoạn DNA còn lại của plasmid. Sau khi phân li (bằng điện di tronggel) và tinh chế, người ta thu lại được đoạn DNA đích đã bị cắt cụt mộtphần và có hai đầu dính, trong đó một đầu đặc hiệu enzyme A còn đầukhác đặc hiệu enzyme B. Dùng enzyme ligase (T4) kết nối với plasmid cócặp đầu dính tương tự ta sẽ lại tổ hợp được đoạn DNA đích đã bị cắt cụt từphía enzyme A (nhưng phía enzyme B vẫn nguyên vẹn). Di nạp tổ hợp nàyvào tế bào khả biến ta có thể kiểm tra được vai trò của phần đã bị cắt cụtcủa DNA đích. Đương nhiên, việc kiểm soát độ dài bị cắt cụt đi của DNAđích là khó khăn, cho nên người ta phải thực hiện với nhiều clone khuyếttổn khác nhau từ những sản phẩm ủ trong thời gian dài ngắn khác nhau vớiBal 31, sau khi phân tích sự biểu hiện của gen trong các clone người ta tiếnhành kiểm tra lại trình tự nucleotide của đoạn còn lại của các clone. Nhờvậy, vai trò của đoạn cắt cụt cũng như độ dài của trình tự đoạn bị cắt cụtđược xác định.1.1. Tiêu hóa từng phần bằng Bal 311) Từ clone đã tìm hiểu vai trò DNA tái tổ hợp ta tinh chế DNA plasmidvà lấy khoảng 30 µg cho xử lý Bal 31, sau đó chiết xuất bằng phenol vàkết tủa bằng ethanol, tráng tủa DNA bằng ethanol 70% và hòa tan trong 30µl TE.2) Thêm vào DNA 150 µl dung dịch đệm Bal 31 2× và 70 µl nước cất(tổng lượng 250 µl), ủ tiền khởi 10 phút ở 30 ºC. Dung dịch đệm Bal 31 2× chứa Tris-HCl (pH 8,0) ở nồng độ 40mM, MgCl2 24mM, CaCl2 24mM, NaCl 1,2mM và EDTA 2mM.3) Thêm 50 µl (1 đơn vị/ml) Bal 31 F (thể F) cho phản ứng xảy ra ở 30 ºC.Sau khoảng 2 phút (hay ngắn hơn) lấy từng 30 µl một cho vào ống đã chứasẵn 2 µl EDTA 0,5M để dừng phản ứng. Kết cục ta có 10 ống dịch đãdừng phản ứng tất cả.4) Từ các ống lấy mỗi ống khoảng 0,2 µl để thực hiện điện di trong gelagarose để xác nhận kết quả tiêu hóa. Trong gel chứa ethidium bromide,dưới đèn UV ta có thể quan sát các làn với các băng DNA có phân tửlượng nhỏ dần (phụ thuộc vào thời gian xử lý Bal 31).5) Chọn DNA trong những ống có kết quả tiêu hóa thích hợp (ước chừng 145nên cần chọn nhiều ống). Thực hiện chiết xuất bằng phenol-chloroform rồikết tủa bằng ethanol. Có thể chiết xuất và tinh chế trước rồi thực hiện điệndi kiểm tra từ bước này (thay cho bước 4) ở trên) cũng được. A B A B A B Hình 13: Sơ đồ quy trình thực hiện tạo thể đột biến đoạn sử dụng Bal 31.DNA nguyên bản được clone hóa trong plasmid nhờ hai ezyme hạn chế (A vàB) bị cắt ở một trong hai vị trí đó (A); 2) cắt dần DNA bởi Sal 31; 3) Làmbằng đầu các DNA bằng Klenow; 4) nối linker tạo vị trí nhận biết của enzymeA; 5) và 6) Cắt bằng cả hai enzyme A và enzyme B; 7) Điện di phân tách; 8)Di nạp DNA đích vào plasmid mới.1.2. Tạo ...