Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử

Tài liệu Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử trình bày các nội dung: khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống, cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử, cơ chất huỳnh quang và phát xạ huỳnh quang theo thời gian, tách sản phẩm trên gel urea-acrylamid. Đây là tài liệu tham khảo môn Sinh học.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Kỹ thuật gen trong sinh học phân tử KỸ THUẬT GEN1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống:Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý vàhóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng,khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v..Các đặc trưng này đôi khicũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vậtnày (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm -gram negative bacteria). Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiềutrường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến nay, đơn vịcơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng caovề các đặc điểm hình thái.Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tậptrung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật riêng biệt. Sự khác biệt của cácphản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật.- API20E KIT,nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹthuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau:cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mấtdo nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trìnhnuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.- Phân biệt bằng thực khuẩn thể:Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn thể xâm nhiễmlàm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ,trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tếbào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt này mà người tadùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu.Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tínhmẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vikhuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khácnữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễmvào vi khuẩn chủ.- Phân biệt theo Typ huyết thanh:Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng(ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào visinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các khánghuyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưngcho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phươngpháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứngkháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặplại.- Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin):Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác.Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocinđó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin.Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phânloại nhưng không có phương pháp nào tỏ ra vạn năng thích hợp cho mọi đối tượng vi sinhvật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi kết hợp nhiều phương pháp khác nhau.2. Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học phân tử: Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệutrong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như các phương pháp truyềnthống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thểáp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật. Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu là: + Phân tích acid nucleic. + Phân tích protein. + Phân tích lipopolysaccharid. + Hóa phân loại học. Trong phần này chúng tôi tập trung giới thiệu một số kỹ thuật phân loại liên quan đếnacid nucleic. Các phần sau chúng tôi lần lượt giới thiệu các phương pháp liên quan đếnpolysaccharid, lipoprotein và hóa phân loại. 2.1. Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích thước, cấu trúc acidnucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN. a. Phân tích ADN plasmid: Phương pháp phân tích ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kíchthước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzym cắt hạn chế, sau đó điện di trên gelagarose v ...