kỹ thuật pha chê mô trường

Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đối với một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác giả đã sử dụng môi trường loại nào.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
kỹ thuật pha chê mô trường KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG1.VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔITRƯỜNGKhi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào đốivới một số đối tượng nhất định, vấn đềđặt ra là chọn môi trường nào và trên cơsở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinhdưỡng. Cách thường làm là qua các tàiliệu đã xuất bản, các công trình đã nghiêncứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tươngđương xem các tác giả đã sử dụng môitrường loại nào. Bước đầu có thể giữnguyên môi trường của tác giả đó hoặctrên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợpqua các thí nghiệm thăm dò.Trong hàng trăm môi trường do rất nhiềutác giả đề nghị cho nhiều loại cây khácnhau, nhiều mục đích nuôi cấy khácnhau. Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại:- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng:điển hình là môi truờng White,Knop vàKnudson C …- Môi trường có hàm lượng chất dinhdưỡng trung bình: điển hình làmôi trườngB5 của Gamborg …- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hìnhlà môi trường MS (Murashige-Skoog)…Vì vậy khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấymô một số đối tượng mới, chưa có tàiliệu trước thì nên thăm dò so sánh 3 loạimôi trường trên xem đối tượng nghiêncứu phù hợp với loại môi trường nàonhất. Sau đó cần thử tìm tỉ lệ NO3/ NH4+thích hợp. Các tác giả phương Tây làmviệc với cây trồng cạn thường không đưaNH4+ vào môi trường. Nhưng đối vớinhững cây dinh dưỡng NH4+ mạnh nhưcây lúa, việc thêm vào môi trường nuôicấy một tỉ lệ NH4+ thích hợp chắc chắn sẽcó lợi. Việc sử dụng mang tính kinhnghiệm chủ nghĩa đối với một số môitrường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộcủa công tác ở một số phòng thí nghiệmnuôi cấy mô thực vật. Thuốc lá và carốtlà 2 loại cây kinh điển của nuôi cấy môthực vật. Môi trường nuôi cấy 2 loại câynày đã được xây dựng khá hoàn chỉnh.Tuy vậy, không thể dùng nguyên các môitrường đó để nghiên cứu các cây hoàthảo hoặc các cây họ đậu mà không có sựcải tiến, sửa đổi. Điều này giải thích sựtiến bộ chậm chạp của nuôi cấy mô mộtsố cây hoà thảo so với cây 2 lá mầm.Hiện nay, môi trường MS được coi nhưlà môi trường thích hợp với nhiều loạicây do giàu và cân bằng về mặt dinhdưỡng. Vì vậy, những người tập sự làmnuôi cấy mô thường bắt đầu với môitrường này trước khi tìm được môitrường của riêng mình.2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNGĐể thuận tiện cho việc pha các môitrường nuôi cấy người ta không cân hoáchất mỗi lần pha mà thường chuẩn bịtrước dưới dạng các dung dịch đậm đặc(còn gọi là các stock), sau đó chỉ cần phaloãng khi sử dụng. Các stock này thườngđược bảo quản dài ngày trong tủ lạnhthường hoặc tủ lạnh sâu.2.1 Thành phần môi trường dinhdưỡngNước cấtChất hữu cơ - Đường- Acid amin-Vitamin (B1, B6, H, PP…)- Các chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật (Auxin,Cytokinin,Gibberellin…)Chất vô cơĐa lượng N P K Ca Mg SVi l ư ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo ICác hợp chất không biết rõ thành phầnNước dừa, nước khoai tây, nước chuối,casein,hydrolysalt, trypton, pepton…THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠBẢN CỦA MÔI TRƯỜNG MS(Murashige và Skoog, 1962)SKOOG I SKOOG II SKOOG IIINH4NO3 :1650 mg/LFeSO4.7H2O : 27,8 mg/LKI : 0,83 mg/LKNO3 : 1900 mg/LMnSO4.4H2O : 22,3 mg/LNa2MoO4.2H2O : 0,25 mg/LKH2PO4 : 170 mg/LH3BO3 : 6,2 mg/LCuSO4.5H2O : 0,025 mg/LMgSO4.7H2O : 370 mg/LZnSO4.7H2O : 8,6 mg/LCoCl2.6H2O : 0,025 mg/LCaCl2.2H2 : 440 mg/LNa2EDTA : 37,3 mg/LTHÀNHPHẦN VITAMIN CỦAMOREL (Morel’sVitamin)Pirydoxine (B6) : 1 mg/LBiotin (H) : 0,01 mg/LMeso-inosito : 100 mg/LNicotinic acid (P.P) : 1 mg/LThiamin –HCl (B1) : 1 mg/LPantotate Calci :1 mg/L2.2 Cách pha các dung dịch mẹ (stock)* Stock đa lượng MS : SKOOG I (x10)(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng khipha 1Lmôi trường MS là 100mL/L)NH4NO3 : 16500 mgKNO3 : 19000 mgKH2PO4 : 1700 mgMgSO4.7H2O : 3700 mgCaCl2.2H2O : 4400 mgCân và dùng nước cất hoà tan lần lượttừng chất trong bécher cho tan hoàn toàn.Dùng ống đong 1L điều chỉnh cho đủ 1lít.* Stock sắt MS: SKOOG II (x100)(Pha thành 200mL với nồng độ sử dụngkhi pha 1L mội trường MS là 2mL/L)Na2EDTA : 3730 mgFeSO4.7H2O : 2780 mgCân và hoà tan từng chất bằng 100mLnước cất trong mỗi bécher riêng.Đặt 2 bécher dung dịch lên bếp và gianhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có hơinóng bốc lên là được. Khuấy đều và đổdung dịch Na2EDTA vào ống đong 200mL, rồi cho từ từ dung dịch FeSO4vào,vừa cho vừa khuấy đều. Để nguộI rồi chovào bình tối bảo quản trong tủ lạnh.* Stock vi lượng MS: SKOOG III(x100)Trước tiên cần chuẩn bị các stock con:Dung dịch KI: (83mg/mL)Cân 8300 mg KI hoà tan với nước cấtcho đủ 100mLDung dịch Na2MoO4.2H2O: (25mg/mL)Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tanvới nước cất cho đủ 100mLDung dịch CuSO4.5H2O (2,5mg/mL)Cân 250mg CuSO4.5H2O hòa tan vớinước cất cho đủ 100mLDung dịch CoCl2.6H2O (2,5 mg/mL)Cân 250 mg CoCl2.5H2O hòa tan vớinước cất cho đủ 100 mLSKOOG III (x100) : pha thành 500mLvới nồng độ sử dụng khi pha 1L môitrường MS là 5mL/LMnSO4.4H2O : 2230 mgH3BO3 : 620 mgZnSO4.7H2O : 860 mgKI : 83 mg/1 mLNa2MoO4.2H2O : 25 mg/1 mLCuSO4.5H2O : 2,5 mg/1 mLCoCl2.6H2O : 2,5 mg ...