Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli)

Nhà máy E. coli. E. coli là loài vật chủ vi khuẩn Gram âm được ưa chuộng nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp. Một trong những lý do là vì những thao tác kỹ thuật với E. coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm. Thông thường, tất cả các chủng E. coli dùng trong biểu hiện đều xuất phát từ chủng E. coli K-12 hay B. Sự khác nhau giữa các chủng biểu hiện được phát triển và thương mại hiện nay là nhằm để giảm thiểu những vấn đề biểu hiện nhất...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Lựa chọn hệ biểu hiện để sản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli) Lựa chọn hệ biểu hiện đểsản xuất protein ở vi khuẩn (Các chủng E. coli )Nhà máy E. coliNhà máy E. coli.E. coli là loài vật chủ vi khuẩnGram âm được ưa chuộng nhấttrong sản xuất protein tái tổ hợp.Một trong những lý do là vì nhữngthao tác kỹ thuật với E. coli khá dễdàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thínghiệm. Thông thường, tất cả cácchủng E. coli dùng trong biểu hiệnđều xuất phát từ chủng E. coli K-12hay B. Sự khác nhau giữa cácchủng biểu hiện được phát triển vàthương mại hiện nay là nhằm đểgiảm thiểu những vấn đề biểu hiệnnhất định (xem chi tiết ở bảng phíadưới). Rất nhiều hệ thống promoterđã được thiết kế cho việc biểu hiệnprotein tuy nhiên chỉ có một số íttrở nên phổ biến và thương mại.Một promoter hữu ích phải có khảnăng biểu hiện mạnh, có một mứcđộ biểu hiện nền thấp và dễ dàngchuyển nạp giữa các chủng E.coli khác nhau. Ngoài ra quá trìnhcảm ứng cũng cần đơn giản và rẻtiền.Một trong những bất lợi trong việcsản xuất protein ở E. coli nhằmmục đích liệu pháp y học là thườnglẫn với lipopolysaccharide, một loạinội độc tố ở người. Vì lý do nhưvậy mà một số loài vật chủ vikhuẩn khác như Caulobacter,Staphylococcus và Streptomycesđược lựa chọn để biểu hiện protein.Các chủng vi khuẩn Bacillus Gramdương cũng là vật chủ được ưathích, trong đó phải kể đến B.megaterium, B. subtilis và B.brevis. Những điểm nổi bật của cácvật chủ này là: hoạt tính proteasethấp, các plasmid tương đối bền vềcả cấu trúc lẫn phân ly trong phânbào, khả năng sinh trưởng trênnhiều loại cơ chất khác nhau vàhiệu suất biểu hiện cực cao. Trongđó, B. subtilis được nghiên cứu sâuvà ứng dụng rộng rãi hơn 2 loài cònlại. Mức độ biểu hiện cao nhất làđạt được ở chủng đột biến sacUh.Chủng WB800 bị bất hoạt tất cảcác protease ngoại bào và đã đượctối ưu hóa quy trình nuôi cấy và lênmen quy mô lớn, tuy nhiên hiện giờchưa được thương mại hóa. Cácplasmid với promoter của operonxylose được sử dụng rộng rãi vàcho mức độ biểu hiện gene caonhất. Những gene này có thể đượccảm ứng từ 130 đến 350 lần với0.5% xylose.Các sản phẩm protein được tạo rathường hay kém tan hoặc nằmtrong các thể không tan (inclusionbodies). Để khắc phục điều này,bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôicấy khi cảm ứng xuống tới 16°C,thay thế các amino acid, biểu hiệnđồng thời với các chaperone, sửdụng đoạn amino acid kèm có tínhưa nước cao, bổ sung thêm vào môitrường nuôi cấy sorbitol, glycylbetain, sucrose, hoặc raffinose, thayđổi pH của môi trường nuôi cấy vàsau cùng có thể đổi chủng vi khuẩnkhác. Tuy nhiên, bạn có thể chọncách khác là hòa tan trở lại và táitạo cấu trúc của protein trong thểkhông tan để thu được protein cóhoạt tính. Việc giảm nồng độ chấtcảm ứng thi thoảng cũng có hiệuquả.Để tăng cường khả năng biểu hiệncác protein eukaryote hoặc proteincó chứa codon hiếm ở E. coli, bạncó thể lựa chọn những chủng E.coli đã được cải biến di truyền phùhợp với mục đích này. Ngoài vấnđề vật chủ, promoter, thì số lượngbản sao plasmid cao, thấp hay trungbình cũng liên quan đến mức độbiểu hiện. Khi gắn protein tái tổhợp với một đoạn cài (tag) lớn cóthể làm tăng tính tan của tổng thểprotein. Các đoạn cài liên kếtmaltose hoặc đoạn cài Sumo(Sumo-tags) có khả năng làmprotein tan cực tốt, tuy nhiên lại kếtvón sau khi loại bỏ đoạn cài khỏiprotein tái tổ hợp. Protein với cáccầu disulfide thường được tiết ravùng ngoại vi bào chất (periplasm)thay vì trong tế bào chất(cytoplasm). Để định hướng tiếtprotein biểu hiện ra vùng ngoại vibào chất, protein tái tổ hợp cầnđược gắn một đoạn peptide dẫnđường (leader peptide) ở phía đầuN. Thông thường các chủng E.coli K-12 hoặc B thường sử dụngcơ chế tiết protein kiểu I và kiểu IIvới các signal peptide sau: Lpp,LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC,OmpF, OmpT, PelB, PhoA, PhoE,SpA và Tat.Đọc đến đây có thể nhiều bạnmuốn đặt câu hỏi: Vậy hệ thốngbiểu hiện nào tốt nhất?. Câu trả lờicó lẽ làm bạn không hài lònglà Không có hệ thống nào là tốtnhất cho mọi trường hợp. Xinđừng thất vọng! Tuy nhiên, nếukhông thì việc thiết kế biểu hiệnprotein sẽ trở nên một công việc tẻnhạt chứ không nâng tầm thànhmột nghệ thuật biểu hiện genenhư hiện nay. Vậy xin nhớ kỹ quytắc ngón tay cái: kiểm tra trình tựprotein trước tiên và sau đó lựachọn một hệ biểu hiện phù hợp. ...