Luận văn thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

Luận văn đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh quang GFP và DsRed; bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạo được để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC -------------------- Nguyễn Thị KhuyếnNGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂNGEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Văn Tuấn Hà Nội - 2016 MỤC LỤC TrangMỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 4Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................................. 61.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae .........................................................61.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae................................................61.1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae .................................................................71.1.3. Vai trò của nấm sợi A. oryzae ..........................................................................................81.1.4. Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin ....91.2. C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi ............................................................... 121.2.1. Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast).......................... 121.2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) ................................. 131.2.3. Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (ATMT) .... 131.2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc c|c chủng chuyển gen .................................... 171.2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm .......................................... 19Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 232.1. Nguyên liệu .............................................................................................................................. 232.1.1. Chủng vi sinh vật................................................................................................................ 232.1.2. Thiết bị v{ hóa chất........................................................................................................... 252.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu..................................................................... 282.2. Phương ph|p nghiên cứu .................................................................................................. 282.2.1. Thu nhận b{o tử nấm....................................................................................................... 292.2.2. T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA ................................................................. 292.2.3. Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa................ 302.2.4. Ph}n biệt A. oryzae v{ A. Flavus bằng c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử ........ 312.2.5. Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen ........................................................ 322.2.6. Chuyển gen v{o nấm sợi A. oryzae ............... Error! Bookmark not defined.Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................... Error! Bookmark not defined.3.1. X|c nhận chủng A. oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen ............... Error!Bookmark not defined.3.1.1. Ph}n biệt c|c chủng A. oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độctố aflatoxin .......................................................................... Error! Bookmark not defined.3.1.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen .Error! Bookmark notdefined.3.2. Lựa chọn marker chuyển gen v{o A. oryzae Error! Bookmark not defined.3.3. X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...... Error!Bookmark not defined.3.3.1. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil ........... Error!Bookmark not defined.3.3.2. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A. oryzae trợ dưỡnguridine/uracil .................................................................... Error! Bookmark not defined.3.4. Đ|nh gi| hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{DsRed Error! Bookmark not defined.3.4.1. Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil.................................................................................................. Error! Bookmark not defined.3.4.2. X|c nhận c|c thể chuyển gen .......................... Erro ...