Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước tiểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR. Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC LÊ THỊ BẢO QUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV-DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: TS. Hoàng Xuân Sử TS. Mai Thị Đàm Linh Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS. Hoàng Xuân Sử, người thầy đã truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cũng như tận tình giúp đỡ, giảng giải và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Mai Thị Đàm Linh, người thầy đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đinh Thị Thu Hằng cùng các cán bộ nhân viên trong phòng thí nghiệm “Vi sinh và các Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong bộ môn Vi sinh vật cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, 18 tháng 2 năm 2020 Học viên Lê Thị Bảo Quyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa Axit amin AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome Bp Base pair BKV BK virus BKVN BK virus nephropathy CMV Cytomegalo virus Ct Cycle Threshold DNA Deoxyribonucleic acid Enzyme - Linked - immunosorbent Assay ELISA (Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme) Etbr Ethidium Bromide EBV Epstein-Barr Virus HBV Hepatitis B virus HSV Herpes Simplex Herpes INF Intravenous Nutritional Fluid F/R Forward/ Reverase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside IVD In vitro diagnostic JCV JC virus Kb Kilobase pairs LB Luria-Bertani NPV Negative predictive value PCR Polymerase Chain Reaction TNF Tumor Necrosis Factors PPV Positive predictive value RCF Relative centrifugal force RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic Rpm Revolutions per minute Super Optimal broth Catabolite repression SOC (Môi trường dinh dưỡng tối ưu) TBE Tris-boric-EDTA UV Ultra violet (Tử ngoại) DANH MỤC BẢNG Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ................30 Bảng 2. 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .....................................31 Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1....................35 Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm........................................42 Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR ......................................................51 Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu ...............................................................................52 Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm .......56 Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl ...................58 Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận ...............................................61 Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng.......................65 Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận..66 Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV ......................................................69 Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV ........................70 Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) .............71 Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV .........................................................72 Bảng 3. 12. Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV .................73 Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu ...............................74 Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng .............................77 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV .................................................................................7 Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV .............................................9 Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu . ...........................................................17 Hình 2. 1. Vector pGEM T easy ...............................................................................29 Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng.......................................................45 Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ h ...