Nghiên cứu áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu này đã xây dựng phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton. Hệ phản gồm 50 µM eicosapentaenoic (EPA), 50 µM metmyoglobin (metMb) và 100 µM H2 O2 . Thời gian phản ứng để tạo ra gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) nhiều nhất từ metMb và H2 O2 là 180 giây. Thời gian thích hợp để oxy hóa EPA kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb ở 300 C là 30 phút. Hoạt tính chống oxy hóa của ESH phân tích bằng hệ phản ứng Fenton có mối tương quan rất cao với kết phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH (R2 = 0,99), tổng năng lực khử (R2 = 0,98) và khả năng khử H2 O2 (R2 = 0,99).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2014 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHẢN ỨNG FENTON ĐỂ PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA FENTON REACTION APPLIED FOR DETERMINING ANTIOXIDATIVE ACTIVITY Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Ngô Thị Hoài Dương2, Phạm Thị Hiền3 Ngày nhận bài: 08/5/2013; Ngày phản biện thông qua: 04/12/2013; Ngày duyệt đăng: 13/8/2014 TÓM TẮT Nghiên cứu này đã xây dựng phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton. Hệ phản gồm 50 µM eicosapentaenoic (EPA), 50 µM metmyoglobin (metMb) và 100 µM H2O2. Thời gian phản ứng để tạo ra gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) nhiều nhất từ metMb và H2O2 là 180 giây. Thời gian thích hợp để oxy hóa EPA kích hoạt bỡi gốc tự do ferrylMb ở 300C là 30 phút. Hoạt tính chống oxy hóa của ESH phân tích bằng hệ phản ứng Fenton có mối tương quan rất cao với kết phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH (R2 = 0,99), tổng năng lực khử (R2 = 0,98) và khả năng khử H2O2 (R2 = 0,99). Từ khóa: phản ứng Fenton, chống oxy hóa, gốc tự do, myoglobin, lipid ABSTRACT This study was to develop new method for determining antioxidant activity based on Fenton reaction. The reaction system included 50 µM eicosapentaenoic (EPA), 50 µM metmyoglobin (metMb) and 100 µM H2O2. The maximum ferrylmyoglobin (ferrylMb) radical level was generated from the reaction between metMb and H2O2 after 180 sec. The incubation time for oxidation of EPA initiated by ferrylMb radical at 370C was 30 min. Antioxidant activity of ESH determined by the Fenton reaction system was in correlation with those of DPPH radical scavenging activity (R2 = 0,99), total reducing power (R2 = 0,98) and H2O2 scavenging activity (R2 = 0,99). Keywords: Fenton reaction, antioxidation, free radical, myoglobin, lipid I. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo xu thế phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm trên thế giới hiện nay, người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng các loại thực phẩm chức năng, thực phẩm thuốc (thực phẩm có tác dụng chữa bệnh) và thực phẩm bổ sung các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Một trong những hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học đó là hoạt tính chống oxy hóa. Các phản ứng oxy hóa thường xảy ra rất nhanh khi bị kích hoạt bởi các gốc tự, khi quá trình oxy hóa diễn ra lại tạo thành các gốc tự do khác, các gốc tự do này tiếp tục tham gia vào quá trình oxy hóa làm cho phản ứng diễn ra mãnh liệt. Các chất chống oxy hóa 1 TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Đại học Nha Trang 2 là những chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa bằng cách khử đi các gốc tự do. Vì vậy, các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa thường dựa vào khả năng khử gốc tự do. Các phản ứng oxy hóa bằng H2O2 với xúc tác bởi ion Fe2+ hoặc Fe3+ tạo thành các gốc tự do hydroxyl (HO•) và ferryl (FeO2+) được gọi là phản ứng Fenton vì đã được H. J. H. Fenton khám phá ra vào năm 1894 khi oxy hóa acid tartaric bởi H2O2 với sự có mặt của ion Fe2+ [1]. Các phản ứng diễn ra như sau: Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO- + HO• Fe3+ + H2O2 → FeO2+ + H2O + H+ Phản ứng Fenton tạo ra gốc tự do hydroxyl và ferryl nên đã được áp dụng để phân tích hoạt tính TS. Ngô Thị Hoài Dương, 3 ThS. Phạm Thị Hiền: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 9 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản chống oxy hóa. Re và cs [12] đã phân tích hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do ABTS•+ (2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6sulphonic acid)) tạo ra nhờ kích hoạt bởi phản ứng Fenton. Caillet và cs [2] đã áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên dựa vào khả năng khử gốc tự do hydroxyl được tạo ra bằng cách oxy hóa acid ethylenediamine tetraacetic bởi Fe2+ và H2O2. Mặc dù đã có những nghiên cứu đã áp dụng phản ứng Fenton để phân tích hoạt tính chống oxy hóa, nhưng các phương pháp này chỉ đánh giá hoạt tính chống oxy hóa gián tiếp dựa vào khả năng khử gốc tự do nên kết quả chưa phản ánh đúng bản chất và năng lực của chất chống oxy hóa. Để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên, nghiên cứu này đã xây dựng phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa bằng mô hình phản ứng Fenton trong hệ eicosapentaenoic (EPA)/metmyoglobin (metMb)/ H2O2 nhằm đánh giá trực tiếp tác dụng chống oxy hóa lipid khi bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylMb tạo ra từ phản ứng giữa Mb và H2O2. Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng sẽ ức chế oxy hóa EPA nên cường độ màu đỏ giảm đi. Dựa vào sự thay đổi cường độ màu đỏ để đánh giá hoạt tính của chất chống oxy hóa. 2.2. Cách tiến hành thí nghiệm 2.2.1. Thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho phản ứng tạo gốc tự do ferrylMb từ metMb và H2O2 Theo nghiên cứu của Menna và cs [7], phản ứng giữa metMb và H2O2 tạo ferrylMb đạt hiệu suất cao nhất và ổn định nhất khi tỷ lệ metMb/H2O2 là 1/2 (50 µM metMb/100 µM H2O2) trong hệ đệm phosphate 50 mM, pH = 7,4. Nghiên cứu của Egawa và cs [3] cũng đã chứng minh rằng gốc tự do ferrylMb tạo thành theo thời gian phản ứng giữa metMb và H2O2 làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm và độ hấp thụ của metMb ở bước sóng 409 nm giảm đi (hình 1). Lượng ferrylMb tạo thành trong hỗn hợp phản ứng càng nhiều thì độ hấp thụ ở bước sóng 421 nm càng tăng. 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2014 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Hóa chất Gốc tự do 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), ergothioneine (ESH), acid eicosapentaenoic (EPA), metmyoglobin (metMb) được mua từ Công ty Sigma - Aldrich, Hoa Kỳ. Tween 20 được mua từ Công ty Loba Chemie, Ấn Độ. Acid thiobarbituric (TBA) được mua từ Công ty Wako, Nhật Bản. Các hóa chất còn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hóa học, được mua từ Công ty Hóa chất Guanghua, Trung Quốc. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Thiết lập hệ phản ứng Trong hệ EPA/metMb/H2O2, phản ứng oxy hóa EPA bị kích hoạt bởi gốc tự do ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng giữa metMb và H2O2. EPA bị oxy hóa tạo thành malo ...