Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho enzyme luciferase trong hệ biểu hiện E.coli

Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho luciferase đom đóm trong vector pGEMT đã được nhân bản bằng PCR và được chuyển vào vector biểu hiện pET43a, để tạo ra vector biểu hiện pET43a-Luc. Vector này được biến nạp vào chủng E.coli BL21-DE3 tạo nên dạng tái tổ hợp BL21-DE3-pET43aLuc.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho enzyme luciferase trong hệ biểu hiện E.coliHóa học & Kỹ thuật môi trường NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME LUCIFERASE TRONG HỆ BIỂU HIỆN E.coli Nghiêm Ngọc Hoa*, Nguyễn Hà Trung, Tô Lan Anh, Trần Thị Thanh Quỳnh, Phạm Kiên Cường Tóm tắt: Luciferase (Luc) là một enzyme quan trọng tham gia vào việc xúc tác cho phản ứng phát quang sinh học. Cơ chế phản ứng phát quang sinh học liên quan đến enzyme luciferase là một quá trình gồm nhiều bước với sự tham gia của ATP, cơ chất luciferin, enzyme luciferase, oxy, ion Magie. Đây cũng là cơ chế phản ứng phát quang sinh học ở đom đóm. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa cho luciferase đom đóm trong vector pGEMT đã được nhân bản bằng PCR và được chuyển vào vector biểu hiện pET43a,để tạo ra vector biểu hiện pET43a-Luc. Vector này được biến nạp vào chủng E.coli BL21-DE3 tạo nên dạng tái tổ hợp BL21-DE3-pET43a- Luc. Sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme Luciferase đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS PAGE và thẩm tách miễn dịch.Từ khóa: Luciferase; Đom đóm; Tái tổ hợp. 1. MỞ ĐẦU Từ phản ứng phát sáng được quan sát ở một số sinh vật như nấm, đom đóm, sứa, vikhuẩn...các nhà hóa sinh học đã tách chiết thành công chất có khả năng thúc đẩy quá trìnhphát sáng trong các tế bào sinh vật và thống nhất gọi chúng là luciferase. Luciferase là mộtthuật ngữ thường được sử dụng để mô tả các enzyme có khả năng xúc tác cho phản ứngphát quang sinh học, thuộc họ protein dạng aldelynate và có một nhóm oxy-4-oxidoreductase để thực hiện các hoạt động chính là khử carboxyl hóa và thủy phân ATP.Bước sóng phát sáng cũng như thành phần tham gia vào phản ứng phát quang ở mỗi loài làkhác nhau. Hiện nay đã có trên 20 loại luciferase khác nhau đã được xác định dựa vàonguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng. Trong đó, luciferase của đom đóm được tậptrung nghiên cứu nhiều nhất [3,4]. Các gen luciferase đã được phân lập từ một số loài đomđóm [8]. Cùng với lợi ích thương mại lớn, các gen luciferase đom đóm đang ngày càngđược sử dụng như một gen chỉ thị trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Trongthực tế các gen luciferase đã được sử dụng như một gen chỉ thị hiệu quả cao trong nhiềusinh vật như amip, vi khuẩn, nấm mốc, thực vật, tằm và chuột. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về luciferase tuy nhiên các công bố về ứng dụngcủa phương pháp phát quang sinh học nói chung và luciferase nói riêng còn hạn chế vàchưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này [1,2]. Đặc biệt là việc ứng dụngenzyme luciferase trong các lĩnh vực phục vụ cho quân đội như trong trinh sát phát hiệnchất độc hóa học còn chưa được quan tâm nghiên cứu. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện enzymeluciferase bằng phương pháp tái tổ hợp ở các hệ thống biểu hiện khác nhau như: vi khuẩnE.coli, tế bào động vật, cây cà rốt và thuốc lá, cá ngựa vằn, ruồi giấm... [6,7,9]. Tuy nhiên,hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E.coli vẫn là sự lựa chọn chủ yếu của các nghiên cứu vì sựđơn giản và hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nhân dòng gen mã hóa enzymeluciferase vào vector pET 43a và biểu hiện ở E.coli. 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất Chủng E. coli DH5α , BL21 DE3 được mua từ hãng Invitrogen.120 N. N. Hoa, …, P. K. Cường, “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa … hệ biểu hiện E.coli.”Nghiên cứu khoa học công nghệ Hỗn hợp dNTP, thang chuẩn DNA được mua từ hãng Fermentas; Taq DNApolymerase, enzyme giới của hãng Enzynomics, T4 DNA ligase của hãng Promega, bộ kittinh sạch plasmid của hãng Anabio R&D JSC. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạchdành cho phân tích và được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk…).2.2. Thiết bị Máy PCR (Bio-Rad, Singapore), máy điện di (Cleaver-Anh), hệ thống phân tích hìnhảnh (Biorad-Italia), máy Deltatox (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma- Đức), máy đo quang phổHalo RB (RB-10), tủ ấm (Memer-Đức), máy đo pH (Mette toledo), máy lắc (Big bill, Mỹ).2.3. Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu2.3.1. Nhân dòng đoạn gen mã hóa enzyme luciferase Gen mã hóa cho enzyme luciferase được nhân bản trực tiếp bằng phương pháp PCR.Đoạn mồi được sử dụng có chứa trình tự nhận biết của enzyme NdeI (Luc-Fw:5’-GATATACATATGGAAAACATGGAGAACGATGAAAAT -3’) và enzyme XhoI (Luc-Rv:5’- GTGCTCGAGCATCTTAGCAACTGG -3’) PCR chứa 1xTaq polymerase buffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs và 2,5 đơn vị Taqpolymerase với tổng thể tích cuối là 25 µl. Quá trình nhân bản được tiến hành bởi máyGeneAmp PCR System 9700 với 1 vòng ở 94oC trong 5 phút để khởi động nóng, tiếp theolà 35 chu kì gồm 30s ở 94oC, 45s ở 53oC, và 2 phút ở 72oC, tiếp theo là kéo dài ở 72oCtrong 7 phút và bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng. Sản phẩm PCR sau khi được tạo thành và vector pET 43a được xử lý bằng enzym giớihạn NdeI XhoI, sau ...