Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia Pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (BB-PDGF-BB) mức độ cao

Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf. Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia Pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (BB-PDGF-BB) mức độ cao TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83 NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VÀ SÀNG LỌC DÒNG NẤM MEN Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP ĐA BẢN SAO BIỂU HIỆN NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG TỪ TIỂU CẦU (BB-PDGF-BB) MỨC ĐỘ CAO Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh, Đặng Thị Phương Thảo*, Trần Linh Thước Trường Đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf. Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường. Từ khóa: Pichia pastoris, dòng đa bản sao, đái tháo đường, PDGF-BB tái tổ hợp. MỞ ĐẦU đổi sau dịch mã. Bên cạnh các ưu điểm trên, hệ PDGF (Platelet derived growth factor) là thống này có tính bền vững di truyền qua nhiều một yếu tố phân bào chủ yếu của nguyên bào thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gen mục sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men sản xuất từ tiểu cầu. PDGF giữ nhiều chức năng theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA trong cơ thể, đặc biệt là chức năng tham gia plasmid và vùng trình tự tương đồng trên bộ gen điều hòa và thúc đẩy quá trình làm lành vết theo 2 cách: (1) gắn chèn vector vào bộ gen thương [6]. Protein này tác động đến nhiều tế nấm men hoặc (2) thay thế gen, loại bỏ hoàn bào liên quan đến quá trình hàn gắn vết thương toàn gen AOX1 trong bộ gen nấm men. Số như: kích thích sự phân bào và hướng hóa của lượng bản sao của gen mục tiêu sát nhập vào bộ nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn, kích thích đại gen chủng chủ nấm men có thể là một trong các thực bào sản xuất và tiết những nhân tố tăng yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện protein trưởng quan trọng, kích thích sự sản sinh những mục tiêu. Hơn nữa, protein ngoại lai được tiết ra phân tử fibronectin, collagen, proteoglycan và ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính, vì thế, hyaluronic acid. Trong giai đoạn tái tạo, PDGF quá trình thu nhận, tinh chế protein dễ dàng hơn có vai trò kích thích sản xuất và tiết collagenase so với protein được biểu hiện ở dạng nội bào. bởi nguyên bào sợi cũng như sự co các sợi Ngoài ra so với Saccharomyces cerevisiae collagen [1]. Với sự gia tăng bệnh đái tháo protein được biểu hiện ở Pichia pastoris không đường như hiện nay, tỷ lệ bệnh nhân mắc chứng bị đường hóa quá mức và không hình thành liên loét chân ngày càng tăng. Tuy nhiên, tại Việt kết α-1,3 glycan, liên kết này được cho là gây ra Nam, nguồn cung cấp PDGF chủ yếu là từ nước đáp ứng miễn dịch khi dùng trong trị liệu [2, 4, ngoài với giá thành cao. Điều này đặt ra yêu cầu 5]. cấp thiết trong việc nghiên cứu công nghệ sản VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU xuất PDGF nhằm phát triển sản phẩm thuốc Vật liệu plasmid pPICZαA (V195-20, điều trị có hiệu quả với giá thành hợp lý. Invitrogen); chủng E. coli DH5α [F-, Trong số các hệ thống biểu hiện protein 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), người tái tổ hợp, Pichia pastoris được xem như phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] một hệ thống nổi bật với nhiều ưu điểm như dễ (Invitrogen) được cung cấp bởi Bộ môn Công nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến nghệ sinh học phân tử và Môi trường, Trường 77  Vuong Cat Khanh et al. Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Bộ gen của các thể biến nạp sau khi pha thành phố Hồ Chí Minh; chủng Pichia pastoris loãng trong khoảng 6.255 ng - 800 ng được X33 (C180-00, Invitrogen). dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid 5’AOX1 và 3’AOX1 trong 20 chu kỳ. Kết quả biểu hiện PDGF-BB (PDGF ...