Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men nội sinh phân lập trên chuối tiêu hồng Musa sapientum L. tại khu vực Gia Lâm, Hà Nội

Bài viết này trình bày một số kết quả thu được qua khảo sát và lấy mẫu chuối Tiêu hồng tại khu vực Gia Lâm - Hà Nội, đồng thời nghiên cứu về đa dạng nấm men nội sinh thông qua đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, hoạt tính enzyme có sử dụng kỹ thuật PCR fingerprinting.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm men nội sinh phân lập trên chuối tiêu hồng Musa sapientum L. tại khu vực Gia Lâm, Hà NộiNghiên cứu khoa học công nghệ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC NẤM MEN NỘI SINH PHÂN LẬP TRÊN CHUỐI TIÊU HỒNG Musa sapientum L. TẠI KHU VỰC GIA LÂM, HÀ NỘI CHU THANH BÌNH, ĐỖ THỊ THU HỒNG, NGÔ CAO CƯỜNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật nội sinh (VSVNS) sống trong mô của tế bào thực vật, không gâyhại cho cây mà thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh học như: Chất điều hòa sinhtrưởng, các chất kháng sinh, nhóm axit pholic… Các hợp chất này đã phát huy vaitrò của nó đối với đời sống cây, kích thích sinh trưởng thực vật, sinh kháng sinh ứcchế sự phát triển bệnh của cây [8]. Chính vì vậy, VSVNS nói chung và nấm men nộisinh nói riêng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu bởi vai trò và ý nghĩa củachúng trong đời sống. Cây chuối là loại cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao... Chuối Tiêuhồng được người tiêu dùng ưa chuộng hơn cả bởi hương vị, thị hiếu. Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm men nội sinh trên đối tượngchuối chưa nhiều. Bài báo này trình bày một số kết quả thu được qua khảo sát và lấymẫu chuối Tiêu hồng tại khu vực Gia Lâm - Hà Nội, đồng thời nghiên cứu về đadạng nấm men nội sinh thông qua đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, hoạt tínhenzyme có sử dụng kỹ thuật PCR fingerprinting. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Mẫu cho phân lập VSVNS từ các bộ phận của cây chuối Tiêu hồng; Hoa - 5mẫu; quả non - 5 mẫu, quả bánh tẻ - 10 mẫu, quả già - 10 mẫu, quả chín - 11 mẫu. - Địa điểm lấy mẫu thuộc địa phận Thượng Thanh, Gia Lâm, Hà Nội; diện tíchkhu vực lấy mẫu khoảng 3600 m2; tọa độ dao động quanh vị trí N: 21o04.625’;E: 105o53.794’. - Môi trường Hansen (g/l): Sacaroza - 30; Pepton - 10; K2HPO4 - 3; MgSO4.7H2O - 3;Yeast Extract - 1; NaCl - 1; được sử dụng để phân lập, làm sạch và giữ giống nấm men. - Môi trường xác định hoạt tính enzyme ngoại bào (cellulase, amylase, protease)bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch (g/l): cơ chất (CMC, tinh bột, casein) - 1;Agar - 15; pH 7. - Mồi MST (IDT Technologies) có trình tự như sau: 5’ - GTG GTG GTGGTG GTG - 3’ [5].Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 11, 12 - 2016 69 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2.2. Phương pháp - Lấy mẫu và bảo quản mẫu theo TCVN 9017:2011 [1]. - Xử lý mẫu trước khi phân lập: Mẫu được rửa sạch phần mô dưới vòi nướcmạnh, cắt thành các đoạn nhỏ 2 ÷ 4 cm để dễ thao tác, sau đó được khử trùng bề mặtmẫu, thực hiện lần lượt từng bước sau: ethanol 70% (5 phút); NaClO 5% (5 phút) vàetanol (30 giây). Rửa lại 5 lần với nước cất vô trùng. Bổ sung 1 ml nước cất khửtrùng. Nghiền nát mô tế bào, hút 100 ÷ 200 μl lên đĩa thạch và trang đều rồi đemnuôi cấy [6, 7]. - Phân loại nấm men dựa trên hình thái khuẩn lạc [9]. - Hoạt tính enzyme: amylase, cellulase, proteinase [3]. - Tách chiết DNA tổng số sử dụng kit tách Norgen, Canada. - Kỹ thuật PCR fingerprinting: Được báo cáo lần đầu vào năm 1985 bởi giáosư Alec Jeffreys (Đại học Leicester, Anh). Đây là phương pháp dùng để phân nhómdưới loài dựa trên sự tương đồng các đoạn ADN vệ tinh. ADN vệ tinh là các đoạnADN có trình tự lặp lại lớn, thường không mã hóa cho gen và ít bị đột biến, thayđổi. Do đó, chúng thường được dùng làm công cụ đắc lực trong phân loại. Sử dụngcác mồi được thiết kế theo trình tự của các ADN vệ tinh trong phản ứng PCR. Sauđó các đoạn ADN vệ tinh đã khuếch đại sẽ được điện di để so sánh kích thước. Sựtương đồng của các phổ băng thể hiện sự gần gũi của các chủng nấm men [4]. - Phản ứng PCR với các thành phần Master mix (Intron) 1 x 10 μl, mồiMicrosatellite primer Transcrip MST (IDT) - 2 μl, nước PCR - 11 μl, DNA khuôn 2 μlvới 35 chu kỳ có chu trình gia nhiệt như sau: 95oC trong 2 phút; 94oC trong 40 giây;52oC trong 60 giây; 72oC trong 2 phút; 72oC trong 10 phút [2]. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phân lập nấm men nội sinh 20 chủng nấm men đã được phân lập từ 41 mẫu chuối Tiêu hồng ở các giaiđoạn sinh trưởng khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 1.70 Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 11, 12 - 2016Nghiên cứu khoa học công nghệ Bảng 1. Kết quả phân lập nấm men nội sinh trên 41 mẫu chuối Tiêu hồng KH mẫu Bộ phận cây chuối KH chủng nấm men 16 16Y1, 16Y3, 16Y4 Hoa 32 32Y1 14 14Y6 Quả bánh tẻ 31 31Y1 ...