Nghiên cứu khoa học Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống'

Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464-468. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đặt vấn đề Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu khoa học " Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464-468. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Đặt vấn đề Trong số hàng nghìn cây gỗ rừng Việt Nam, có tới hàng trăm loài đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau, một số loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng mà nguyên nhân chủ yếu vẫn là hậu quả của việc tàn phá môi trường sống và thu hẹp diện tích rừng tự nhiên. Cây Lim Xanh Erythrophleum fordii Oliv. còn gọi là cây Lim, họ phụ Vang Caesalpinioideae, họ Đậu Leguminosae. Lim xanh là loài cây gỗ quý, nổi tiếng từ lâu đời, có giá trị kinh tế cao và hiện vẫn đang được ưa chuộng trên thị trường [1]. Lim xanh có phân bố trải dài suốt từ Quảng Ninh đến Quảng Bình trong đó có các xuất xứ nổi tiếng như Cầu Hai, Chân Mộng (Vĩnh Phú), Ba Vì, Sơn Tây (Hà Tây), Mai Sưu (Hà Bắc) hoặc Hữu Lũng (Lạng Sơn) song đến nay khó tìm thấy những quần thụ lim rộng lớn mà chỉ còn một số cá thể rải rác [12]. Hiện nay Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã sưu tầm và bảo tồn cây Lim xanh từ nhiều xuất xứ khác nhau. Câu hỏi được đặt ra là liệu các xuất xứ này có trùng lặp nhau hay không?, chúng ta có cần thiết phải bảo tồn nguồn gen Lim xanh ở tất cả các xuất xứ hay không? Những năm gần đây các chỉ thị phân tử được dùng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại ở nhiều loại cây. Trong số đó, chỉ thị RAPD được sử dụng rộng rãi nhất, bởi kỹ thuật này đơn giản và ít tốn kém. RAPD đã được sử dụng để xác định giống [4,5] và mối quan hệ phát sinh loài ở Citrus [6]. Việc sử dụng chỉ thị ADN lục lạp (cpDNA) trong phân tích phát sinh loài đã mang lại những kết quả rất lý thú bởi tính bảo thủ của nó trong thiên nhiên, tần số đột biến thấp hơn ADN nhân và có kích thước nhỏ. Sự đa hình của ADN lục lạp được sử dụng trong nhiều nghiên cứu xác định mối quan hệ địa lý hoặc đa dạng di truyền các loài [3,10]. Phản ứng PCR để nhân các vùng không mã hoá của cpDNA với các mồi lục lạp phổ biến, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng các enzym cắt hạn chế để tìm đa hình đã được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài ở Citrus . Trong bài này, chúng tôi trình bày những kết quả về sử dụng chỉ RAPD và cpDNA trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ cây Lim xanh nhằm đưa ra khuyến cáo về việc bảo tồn nguồn gen đối với loài cây quan trọng này. Nguyên liệu và phương pháp Nguyên liệu 1 Chín mẫu xuất xứ Lim xanh (Thanh Hoá, Ba Vì, Hà Bắc, Đông Giang, Lang Hanh, Nghệ An, Cầu Hai, Tam Đảo, Quảng Ninh) do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp. Hoá chất chuẩn được mua từ các hãng Sigma và Amersham (Mỹ). Các mồi RAPD (C1, C7, C9, B1, B4, B9) được mua từ hãng Operon - Mỹ. Các mồi lục lạp (cpDNA) trnH-trnK, PsbC-trnS được mua từ hãng Fermentas theo trình tự đã công bố [9] . Phương pháp Nghiên cứu đa dạng loài. Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành như đã công bố [2]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh bằng hệ thống Thermal Imaging System FTI-500, Pharmacia Biotech. Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp. Phản ứng PCR của ADN genome các xuất xứ Lim xanh với hai cặp mồi cpDNA (20 nucleotide) được tiến hành với tổng thể tích là 25 μl/mẫu gồm: ADN tổng số (12 ng), dNTP (0,2 mM), mồi cpDNA (10 ng), MgCl2 (1,5 mM), Taq polymerase (2 đơn vị) và 2,5 μl đệm 10xPCR. Chu trình nhiệt: 920C 2 phút; 10 chu kỳ gồm các bước: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút; 20 chu kỳ gồm các bước sau: 920C 5 giây, 550C 15 giây, 720C 1 phút 10 giây; cuối cùng kéo dài ở 720C 10 phút [7,8]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím. Phân đoạn ADN duy nhất nhận được từ sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được cắt bằng các enzym cắt hạn chế Tag I, Hha I, Hinf I và sau đó điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh. Phân tích số liệu Các số liệu được đưa vào xử lý bằng chương trình NTSYS pc (Rohlf F. J, 1993) [11] để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền. Kết quả nghiên cứu và thảo luận Phân tích đa hình di truyền ở các xuất xứ Lim xanh bằng các chỉ thị RAPD Trung bình mỗi mồi cho 5,2 đến 9,7 phân đoạn (hình 1). Tổng số 428 băng đa hình/428 băng nhận được từ các phản ứng PCR ADN genome từ 9 xuất xứ với 6 mồi RAPD. Như vậy là tỷ lệ đa hình đạt 100%. Số phân đoạn đa hình ở từng mồi là rất cao, đạt 47-87 phân đoạn. Mồi C7 cho số phân đoạn đa hình thấp nhất cũng đạt 47 phân đoạn ở 9 xuất xứ, mồi C1 và B1 cho số phân đoạn đa hình cao nhất, 87 phân đoạn. ở 9 xuất xứ Lim xanh, số phân đoạn trung bình từ 5 đến 11. Xuất xứ Nghệ An cho số phân đoạn trung bình thấp nhất (5 phân đoạn), xuất xứ Hà Bắc cho số phân đoạn trung bình cao nhất (11 phân đoạn). Cả chín xuất xứ đều cho số phân đoạn đa hình bằng số phân đoạn đếm được, nghĩa là tỷ lệ phân đoạn đa hình ở 9 xuất xứ Lim đều đạt 100%. Như vậy, bước đầu dựa trên các chỉ thị RAPD chúng tôi có nhận xét là các xuất xứ Lim xanh rất đa dạng về mặt di truyền. Bảng 1. Tỷ lệ đa hình của 9 xuất xứ Lim xanh với chỉ thị RAPD 2 Ký Xuất xứ Tổng số băng Tổng số băng Số băng tb ở Tỷ lệ băng đa hiệu đếm được ...