Nghiên cứu khoa học SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN

Phương pháp phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn Eucalyptus obliqua được dựa vào phân tử DNA tách chiết từ 26 mẫu gỗ bạch đàn bị mục thu thập tại Tasmania (Australia). Ri-bô-xôm DNA được khuyếch đại (PCR) bởi cặp mồi điền hình ITS1-F/ITS4 chỉ phát hiện được 18 mẫu có DNA.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu khoa học " SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN "Tạp chí NN và PTNT số 117-2007, trang 59-64SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN Eucalyptus obliqua L. Her. Trần Thanh Trăng Viện Khoa học Lâm nghiệp Viêt NamTÓM TẮTPhương pháp phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn Eucalyptus obliqua được dựa vào phân tử DNAtách chiết từ 26 mẫu gỗ bạch đàn bị mục thu thập tại Tasmania (Australia). Ri-bô-xôm DNA được khuyếch đại (PCR)bởi cặp mồi điền hình ITS1-F/ITS4 chỉ phát hiện được 18 mẫu có DNA. Trên bản gel cho thấy có 11 mẫu chỉ có 1 dảiDNA và 7 mẫu cho nhiều dải DNA. Vùng sao chép nội bộ (ITS) của 11 mẫu được xác định trình tự chuỗi trực tiếp và7 mẫu có sản phẩm PCR thể hiện có nhiều loài nấm cùng xuất hiện được tách dòng. Sản phẩm tách dòng được phântích bằng phương pháp PCR-RFLP, đại diện của mỗi nhóm PCR-RFLP được xác định trình tự chuỗi. Để xác định cácloài nấm mục gỗ trong mẫu thí nghiệm, các chuỗi ITS được so sánh hoặc phân tích sự tiến hóa với các cơ sở dữ liệutrên ngân hàng gen (Genbank) và các cơ sở dữ liệu cá nhân. Kết quả phân tích DNA từ các mẫu gỗ mục đã xác địnhđược 15 loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, 17 loài nấm thuộc lớp Ascomycetes và 1 loài thuộc lớp Zygomycetes.Trong tổng số 33 loài nấm phát hiện được trong mẫu gỗ, chỉ có 13 loài thuộc lớp nấm Basidiomycetes và 7 loài thuộclớp nấm Ascomycetes là những loài gây mục gỗ thực sự, còn 13 loài khác là các loài thứ sinh.Từ khóa: Bạch đàn Eucalyptus obliqua, DNA, nấm gây mục gỗ, PCR-RFLP.I. ĐẶT VẤN ĐỀBạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổngsố 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng đểđóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấmgây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm.Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng và độ bền. Xác định đượcnấm bệnh và các đặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quản lý. Có rất nhiều loàinấm không thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởi vậymột số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánh chính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật.Bên cạnh đó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loài nấm gây mục gỗ chủ yếu, có thểphân lập được nhưng hệ sợi lại không sinh ra bào tử hữu tính, đó là đặc điểm chính để xác địnhbằng phương pháp hình thái (Nobles 1948). Đã có nhiều phương pháp được sử dụng để xác địnhnấm gây bệnh mục gỗ, như phân lập sợi nấm và xác định bằng hình thái sợi, nhuộm màu hóa học,cộng hưởng phân tử từ, phương pháp huyết thanh (hay phương pháp ELISA) (Jasalavich 2000).Bên cạnh đó, phương pháp phân tử PCR (Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuyếchđại các phân đoạn điển hình của DNA, ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chínhxác và phát hiện nấm bệnh ở giai đoạn rất sớm mà một số phương pháp trên không thể áp dụng.Phát hiện nấm bệnh bởi phương pháp PCR và xác định nấm bệnh bằng phương pháp xác định trìnhtự chuỗi trực tiếp t ừ các mẫu mô thực vật sẽ tránh được các bước khó khăn trong phân lập và duytrì sợi nấm tinh khiết trên môi trường nhân tạo. Vùng sao chép nội bộ ITS (internal transcribedspacer) của ri-bô-xôm DNA là vùng phù hợp cho sự phân biệt các loài nấm (Mitchell et al. 1995).Bài viết này trình bày kết quả nghiên cứu về phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để pháthiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bang Tasmania.II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11. Nội dung- Phát hiện nấm trong mẫu gỗ mục bằng kỹ thuật DNA.- Giám định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua bằng kỹ thuật DNA.2. Vật liệuĐề tài sử dụng 26 mẫu gỗ mục được lấy mẫu từ các khúc gỗ mục ở giai đoạn trung bình của rừngbạch đàn E. obliqua tại Tasmania để xác định nấm mục gỗ bằng phương pháp phân tử và đượcthực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Khoa học Nông nghiệp, trường Đại họcTasmania, Australia.3. Phương phápTách DNA: Lấy phoi gỗ mục được thực hiện theo phương pháp của Jasalavich và đồng tác giả(2000) bằng cách sử dụng khoan sách tay. Phương pháp khử trùng bề mặt và thay thế mũi khoantrong mỗi lần khoan được áp dụng để tránh sự lấy nhiễm DNA giữa các mẫu gỗ. Tách DNA củacác loài nấm mục gỗ sử dụng phương pháp glassmilk của Glen và đồng tác giả (2002). Cho mộtlượng nhỏ phoi gỗ đến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ốngeppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm ...