Nghiên cứu sản xuất Ecotin miniproinsulin từ tế bào Escherichia Coli tái tổ hợp

Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng dòng tế bào E. coli tái tổ hợp (đã được tạo ra từ nghiên cứu trước) để xây dựng quy trình sản xuất ecotin-miniproinsulin (EMPI) ở quy mô phòng thí nghiệm sau đó, sản xuất insulin người giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu trong nước.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu sản xuất Ecotin miniproinsulin từ tế bào Escherichia Coli tái tổ hợp N G H IỀ N C Ứ U S ẢN X U Ấ T E C O T IN M INIPROINSULIN T Ừ T Ế B À O ESCHERICHIA COLI T Á I T H P Ths. M ai H ư ng Trà* H ư ở ng dẫn: T S. Võ M in h Trí** TÓM TẴT Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose trong máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, cơ thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ãn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh... Bệnh xảy ra do hormone insulin của tuyển tụy bị thiếu hoặc insulin đủ nhưng hoạt động kém hiệu quà (Glesỉie R.D, 1994). Những nghiên cứu trên thể giới cho thấy rằng Ecotin, protein ức chế trypsin ờ E. coỉi được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một Ư nh tự tiết nằm ở đầu N của Ecotin. Bằng cách đung hợp tr nh tự tiết và tr nh tự mã hóa Ecotin vào đầu N của proinsulin th proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất và sự tái gấp cuộn của proinsulin có hiệu quả cao so với việc dung hợp với các peptide ĩín hiệu của các gen p lB, dsbA, hay om pĩ (Ajamaluddin Maỉik t al, 2007). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử đụng đòng tế bào E. coli tái tổ hợp (đã được tạo ra từ nghiên cứu trước) để xây dựng quy tr nh sản xuất ecotin­miniproinsulin (EMPI) ờ quy mô phòng thí nghiệm sau đó, sản xuất insulin người giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu trong nước. Kếỉ quả cho thấy: hàm lượng ecolin­MPI thu được sau lên men là 20,4mg/l trong môi inrờng có bổ sung ethanol 1% và sau khi tinh sạch là 13,87mg/l, với hiệu suất thu hồi đạt 68%. * Từ khóa: Đái tháo đường; Ecotin ­ miniproinsulin; Insulin; Esch richia coli tái tổ họp. Pr paration of Ecotin - miniproinsulin from r combinant Esch richm colỉ Summary Diabetes is a glucose metabolic disorder disease, causing an increase in high glucose in blood, which is due to deficiency o f pancreatic insulin or inefficient insulin (Glesiie R.D, 1994). N ative pro­insu in belongs to theclassof the difficult­to­express proteins in Escherichia coli. In this study, we used E. coli recombinant cell lines (that had been created from the previous study) to develop an Ecotin­miniproinsulin (EMPI) manufacturing process in the laboratory scale, which aimed to produce human insulin at cheap cost which can meet domestic demand. The results showed that the level of MPI ecotin­obiained after fermentation was 20.4 mg/1 in medium supplemented with ethanol 1% and after purification was 13.87 mg/ , with 68% of recovery yield. * Key words: Diabetes, Ecotin ­ miniproinsulin; insulin; Recombinant Esch richia coli. I. Đ Ặ T V Ấ N Đ È Số lượng bệnh nhân ĐTĐ ngày càng gia tăng khiên nhu cầu cần insulin là rất lớn. Tuy nhiên, nguồn insulin trích từ động vật không đủ và có nhiều rủi ro nên việc sản xuất insulin người bằng protein tái tổ hợp đã và đang là giải pháp hiệu quả nhất hiện nay. Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn Gram âm E. coli là một trong những ưu tiên làm tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng ecotin ở E. coli được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một tr nh tự tiết nằm ở đầu N. Bằng cách dung hợp tr nh tự tiết và tr nh tự mã hóa ecotin vào đầu N cùa proinsulin, proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất, giứp pronsulin có cấu h nh tự nhiên. M ặt khác, khi đung họp vói tín hiệu tiết là ecotin th hiệu suất proinsulin thu được cao hơn hẳn so với dung hợp các peptide tín hiệu của các gen p lB, dsbA , hay ompT với năng suất đạt được ỉà 51 mg proinsuỉin/1 dịch lên men (Ajamaluddin M alik t al, 2007). n . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Vật liệu Chủng chủ E. colỉ B834(DE3) [F~ompT hsdSiiịrũmũ) gal dcm m t (DE3)] được dùng để nghiên cứu biểu hiện gen trong plasmid pET43EMPI và lên men ở quy mô phòng thí nghiệm. * Đại học Lạc H ồng ** Đại học Khoa học T ự n h iên TP. Hồ C h í M inh 593 2.2. P hư on g p h áp 2.2.1. C m ứng biểu h i n ecotỉn - M P I trong phân đoạn chu chất của E. coli a. Tạo shock thẩm thấu và kiểm tra khả năng tiết cùa cotin-M PỈ trong chu chất Thu 1,5 ml dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng IPTG vào eppendorf. Ly tâm 10.000 vòng, 5 phút. Sinh khối được huyền phù trong 200 ịú dung dịch chứa sucrose 25%, Tris­HCl 0,3M, M gCl2 0,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8. Đễ eppendorf ở nhiệt độ phòng 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 5 pht t, 4°c. Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 100 |*i dung dịch đã làm lạnh chứa M gCl20,5 H Í, EDTA 1 mM, Tris­HCI 10 mM, pH 8, để trong đá 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng, 15 phứt, 4°c. Dịch nổi (phân đoạn chu chất) được thu nhận (Ajamaluddin M alik và c s , 2007). Phân tích sự hiện diện cùa ecotm ­M PĨ trong chu chất bằng điện di SDS­PAG ...