Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định các điều kiện của kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR đ xác định một s ch ng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicansTẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP KỸ THUẬT SEMINESTED PCRPHÁT HIỆN NẤM CANDIDA ALBICANSĐỗ Ngọc Ánh*; Hoàng Cao Sạ**Đoàn Ngọc Giang Lâm***; Phạm Văn Minh*TÓM TẮTMục tiêu: xác định điều kiện và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấmCandida albicans. Phương pháp: thiết lập kỹ thuật seminested PCR trên cơ sở gen đích mã hóa®rARN của chủng nấm Candida albicans ATCC 90028 và đánh giá thử trên 27 chủng nấm Candidaalbicans phân lập ở Việt Nam. Kết quả: xác định được điều kiện phản ứng PCR1, PCR2 cũng2+như ngưỡng phát hiện, tính đặc hiệu của kỹ thuật. PCR 1: nồng độ Mg 1,5 mM, dNTPs 150 µM,o2+nồng độ mồi 0,2 - 0,3 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi là 55 C. PCR2: nồng độ Mg 2,0 mM, dNTPso200 µM, nồng độ mồi 0,2 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi 55,2 C. Kỹ thuật seminested PCR cókhả năng phát hiện chính xác nấm C. abicans ở ngưỡng ≥ 10 pg/µl. Sau khi được thiết lập,đánh giá kỹ thuật trên ADN của 27 chủng C. albicans phân lập ở Việt Nam, kết quả cho thấy,cả 27 chủng đều cho band đặc hiệu có kích thước 410 bp như mong đợi. Kết luận: kỹ thuậtseminested PCR thu được cho phép xác định chính xác nấm Candida albicans.* Từ khóa: Candida albicans; Seminested PCR.Development of Seminested PCR for Detection of Candida AlbicansSummaryAims: To establish and evaluate a system of seminested polymerase chain reaction (PCR)®assays to identify Candida albicans. Methods: DNA of Candida albicans ATCC 90028 and27 samples from Vietnam was extracted and used as a template in PCR assays targetingthe ribosomal DNA of Candida albicans. Results: PCR1 and PCR2 assays were optimized to2+detect exactly rRNA gene of Candida albicans. PCR1 with 1.5 mM Mg , 150 µM of eachodeoxyribonucleotide, 0.2 - 0.3 pmol/µl of each primer and annealing temperature 55 C. PCR22+with 1.5 mM Mg , 200 µM of each deoxyribonucleotide, 0.2 pmol/µl of each primer and annealingotemperature 55.2 C. The limited concentration for detection of C. albicans was not less than10 pg per µl DNA of C. albicans in total volume of PCR1 assay. We obtained positive reactionsfor all 27/27 samples from patients who had been previously diagnosed with Candidiasis ofC. albicans by conventional techniques. Conclusions: The seminested PCR assays describedhere can support the diagnosis of Candida albicans.* Key words: Candida albicans; Seminested PCR.* Học viện Quân y** Bệnh viện Đa khoa Nam Định*** Bệnh viện TWQĐ 108Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Ngọc Ánh (dranhk61@gmail.com)Ngày nhận bài: 30/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/07/2015Ngày bài báo được đăng: 20/07/201527TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015ĐẶT VẤN ĐỀCandida sp. là nấm men sống hội sinhtrong đường tiêu hóa và đường sinh dục,có ở 70% dân số và ít nhất khoảng 75%phụ nữ bị nhiễm nấm này một lần trong đời[5, 6]. Tuy nhiên, ở những cơ thể có nhiềuyếu tố thuận lợi, nấm này sẽ chuyển từhội sinh sang gây bệnh. Bệnh do nấmCandida sp. có thể được phân thành hainhóm: nhóm gây tổn thương ở da, niêmmạc và nhóm gây bệnh nội tạng. Bệnhnấm Candida sp. nội tạng rất trầm trọng,chúng đe dọa mạng sống và tû lệ tử vonglên có thể lên tới 30% [9]. Đối với nhiễmCandida sp. máu, tỷ lệ tử vong có thể lêntới 50% [7, 8], đặc biệt đối với trẻ sơ sinh[10]. Vì những lý do trên, Candida sp. đãtrở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểmđối với người. Việc xác định chính xác cănnguyên gây bệnh đóng vai trò quan trọngtrong lựa chọn phương pháp điều trị.Do đó, ở người nghi nhiễm Candida sp.,nấm và loài nấm gây bệnh cần được pháthiện, xác định sớm để có biện pháp điềutrị kịp thời. Trong số các Candida sp.,Candida albicans là loài nấm phổ biến nhất.Một số nấm khác có thể gặp nhưng ít hơnlà Candida glabrata, Candida krusei,Candida dubliniensis, Candida parapsilosisvà Candida tropicalis [4].Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoánnấm được sử dụng chủ yếu hiện nay là:phương pháp xét nghiệm trực tiếp, phươngpháp nuôi cấy, phương pháp huyết thanh.Ƣu điểm của phương pháp xét nghiệmtrực tiếp bằng soi tươi là nhanh, đơn giản,dễ thực hiện, độ đặc hiệu cao nhưng độnhạy thấp. Nuôi cấy có độ chính xác cao28hơn soi tươi nhưng phải sau 3 - 5 ngàymới có kết quả [3]. Phát hiện khángnguyên vỏ tuy độ nhạy cao hơn nhưng độđặc hiệu thấp, tỷ lệ dương tính giả và âmtính giả cao. Mặt khác, trong trường hợpnấm gây bệnh ở máu, mô chẩn đoánbằng các phương pháp này gặp nhiềukhó khăn. Hơn nữa, ngay cả khi đã phânlập được nấm, việc xác định loài nấm đólà loài gì bằng phương pháp truyền thốngcũng gặp nhiều khó khăn, cần nhiều thờigian [3].Hiện nay, công nghệ sinh học phân tửphát triển đã giúp xác định nhanh loài củamột vi sinh vật với độ nhạy và độ đặc hiệucao. Tuy nhiên, vấn đề ứng dụng kỹ thuậtsinh học phân tử trong chẩn đoán nấm ởViệt Nam còn mới mẻ. Nhằm góp phầnphát triển kỹ thuật sinh học phân tử vàochẩn đoán nấm ở Việt Nam, chún ...