Phân biệt thịt bò, trâu, heo bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR

Mục tiêu của nghiên cứu là tối ưu quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bò, trâu, heo, từ đó ứng dụng để phát hiện gian lận thương mại. Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM và đoạn dò 100 nM (bò và trâu), nồng độ mồi 300 nM và đoạn dò 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ gồm biến tính ở 950C/15 giây và bắt cặp – kéo dài ở 600C/40 giây. Mời các bạn cùng tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phân biệt thịt bò, trâu, heo bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCRPHÂN BIỆT THỊT BÒ, TRÂU, HEO BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME PCR A MULTIPLEX REALTIME PCR METHOD TO DISCRIMINATE MEAT OF BEEF, BUFFALO AND PORK Trần Minh Tấn1,*, Nguyễn Ngọc Tuân2,** 1 Chi cục Thú y vùng VI tại TP HCM 2 GV thỉnh giảng Bộ môn Thú y, Viện Khoa học Ứng dụng, trường ĐH Công nghệ TP HCM Email: *tranminhtan06@gmail.com, **nntttd@gmail.comTÓM TẮTMục tiêu của nghiên cứu là tối ưu quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bò, trâu, heo, từ đóứng dụng để phát hiện gian lận thương mại. Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM và đoạn dò 100 nM(bò và trâu), nồng độ mồi 300 nM và đoạn dò 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45chu kỳ gồm biến tính ở 950C/15 giây và bắt cặp – kéo dài ở 600C/40 giây. Quy trình có độ nhạy và độ đặchiệu cao, giới hạn phát hiện của phương pháp đối với hỗn hợp mẫu thịt tươi và thịt đã xử lý nhiệt (80-1200C/15 phút) là 0,1% theo khối lượng hoặc 0,005 ng DNA/phản ứng. Áp dụng quy trình để kiểm tra sảnphẩm thịt chế biến trên thị trường đã phát hiện sự gian lận. Kết quả sơ bộ cho thấy 66,67% (8/12) mẫu xúcxích bò chứa thịt trâu trong sản phẩm. Tất cả 12 mẫu bò viên được kiểm tra đều phát hiện DNA bò nhưng66,67% mẫu lẫn thịt trâu và 16,67% mẫu lẫn thịt heo.Từ khóa: DNA, multiplex realtime PCR, gian lận, thịt bò-trâu-heo.1. ĐẶT VẤN ĐỀXác định loài trong sản phẩm thịt là một lĩnh vực được phát triển nhanh chóng do có liên quan đến tôngiáo, gian lận thương mại và sức khỏe người tiêu dùng. Trên thị trường, nhiều sản phẩm thịt tươi và sảnphẩm thịt chế biến không ghi đúng nhãn hiệu, thành phần các loại thịt nhằm gian lận, lừa dối người tiêudùng để thu lợi bất chính. Theo các báo cáo trước đây, khoảng 22% thịt và sản phẩm thịt chế biến ở ThổNhĩ Kỳ chứa loại thịt không được ghi trên nhãn [1]. Tại Thổ Nhĩ Kỳ, mẫu xúc xích với nhãn ghi 5% thịtbò lại không phát hiện DNA bò trong sản phẩm và thịt bò viên ghi nhãn là thịt bò 100% lại phát hiện đượcthịt gà và gà tây [10]. Tháng 07/2016, Trung tâm giám định pháp y (Sở Y tế TP. HCM) thông báo kết quảgiám định bò viên của một công ty tại TP HCM cho thấy mẫu bò viên nhãn hiệu GoGo chỉ có DNA cá,không tìm thấy DNA bò, và mẫu bò viên nhãn hiệu Merlion chỉ có DNA trâu và cá nhưng không có DNAbò [9]. Như vậy, thịt bò và sản phẩm từ thịt bò có giá trị kinh tế cao đã được làm giả từ thịt trâu, thịt heohoặc cá nhằm thu lợi bất chính. Hiện nay, Việt Nam cũng như một số nước không cho phép nhập bột thịtxương có nguồn gốc từ bò, cừu ở các nước và vùng lãnh thổ bị bệnh BSE để làm nguyên liệu sản xuấtthức ăn gia súc.1020Ngày nay, có nhiều phương pháp phân biệt các loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt. Phương pháp pháthiện dựa vào protein như điện di, miễn dịch, sắc ký. Nhược điểm là cho kết quả chậm hoặc không thể ápdụng với sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt độ cao. Phương pháp dựa vào DNA được sử dụng nhiều hơn nhưkhuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA-RAPD, PCR đặc trưng cho loài. Theo đó một số công trình đã đượccông bố như Matsunaga và ctv [5] sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện sáu loại thịt bò-heo-cừu-dê-ngựa-gà từ hỗn hợp thịt tươi và thịt chế biến nhưng không thể phân biệt thịt trâu và bò. Cho nên ĐoànThị Tuyết Lê và Nguyễn Ngọc Tuân [2] đã thiết kế mồi và xây dựng quy trình PCR để khẳng định tronghỗn hợp thịt bò có lẫn thịt trâu hay không.Kỹ thuật multiplex PCR cho phép phát hiện nhiều gene đích của nhiều loài khác nhau trong cùng một sảnphẩm thịt. Để tăng độ tin cậy của phản ứng bằng việc sử dụng các đoạn dò (probe) đặc hiệu và rút ngắnthời gian thu kết quả, kỹ thuật multiplex realtime PCR đã được áp dụng như Rentsch và ctv [8] phát hiệnDNA bò, dê, cừu, trâu trong sữa và phô mai..Mục tiêu của bài báo là tối ưu hóa quy trình multiplex realtime PCR nhận diện DNA bò, trâu, heo trongđiều kiện hiện tại của một phòng thí nghiệm, từ đó ứng dụng quy trình để phân biệt nhanh loại thịt trongsản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu.2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP2.1. Chuẩn bị mẫuHai mươi bốn mẫu thịt tươi (bò, heo, trâu) được thu thập từ một số lò mổ và mẫu thịt kiểm dịch nhập khẩutại TP Hồ Chí Minh. Mẫu được bảo quản lạnh đông -20oC đến khi tiến hành thử nghiệm. Mỗi mẫu thịttươi được lấy khoảng 100 gam cho vào túi nylon sạch, dán nhãn riêng. Ba mươi mẫu thịt từ 15 loài độngvật và thủy sản khác được thu thập để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu (02 mẫu mồi loài). Bao gồm nhómthú ăn cỏ (cừu, dê, ngựa), nhóm gia cầm (gà, cút, vịt, ngan), nhóm thú ăn thịt (chó, mèo), nhóm thú gậmnhấm (thỏ, chuột) và nhóm hải sản (tôm, cá). Ngoài ra, đậu nành cũng được kiểm tra đánh giá độ nhạy, độđặc hiệu vì đây là th ...