Phản ứng chuỗi polymerase (pcr)

Thử nghiệm PCR đã thật sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử với các áp dụng kỳ diệu trong mọi lãnh vực. Ngày nay PCR có thể được triển khai áp dụng tại bất cứ một phòng thí nghiệm nào thử nghiệm được thực hiện tương đối đơn giản, giá thành của thử nghiệm không còn quá cao đến nỗi không thể chấp nhận được như trước đây.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) Phản ứng chuỗi polymerase (pcr)TÓM TẮT : Thử nghiệm PCR đã thật sự làmmột cuộc đại cách mạng trong sinh họcphân tử với các áp dụng kỳ diệu trong mọilãnh vực. Ngày nay PCR có thể được triểnkhai áp dụng tại bất cứ một phòng thínghiệm nào thử nghiệm được thực hiệntương đối đơn giản, giá thành của thửnghiệm không còn quá cao đến nỗi khôngthể chấp nhận được như trước đây.PCR, THE GREAT REVOLUTION INMOLECULAR BIOLOGYSUMMARY With the fantastic applications inall scientific fields, PCR has really done agreat revolution in molecular biology.Today PCR can be set up at any laboratorybecause the PCR technique is very simple,and the price cost of one test in notunacceptable as before. Vào năm 1985, trong một đêmtrăng sáng ở tiểu bang California , trênđường lái xe dọc theo bờ biển, một ýtưởng chợt xuất hiện trong đầu của mộtnhà sinh hóa học rất tầm thường, làm việccũng tại một phòng thí nghiệm hết sức tầmthường. Ý tưởng này khi trở thành hiệnthực, chính là thử nghiệm PCR, đã làmmột cuộc đại cách mạng trong sinh họcphân tử và đã đưa tác giả của nó, K.BMullis, đến giải Nobel y học.THỬ NGHIỆM PCR LÀ GÌ ? Nguyên tắc của thử nghiệm PCR PCR là một thử nghiệm nhằmkhuếch đại chuỗi nucleic acid đích thànhhàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiệnđược. Ðể thực hiện được việc khuyếch đạiacid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựavào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có3 bước (hình 1), mỗi bước kéo dài khoảngvài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau: (1) Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lênkhoảng 940C để làm biến tính nucleic acidđích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợiđơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biếntính (denaturation) DNA đích (11) . Kế đólà giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc nàynhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuốngkhoảng 550C để các đoạn mồi (primer) bắtcặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầucủa chuỗi nucleic acid đích, đây là giaiđoạn quyết định nên tính đặc hiệu thìnhững sản phẩm PCR (PCR product) sẽđặc hiệu (111) Cuối cùng là giai đoạn kéodài (extension), lúc này nhiệt độ đượcnâng lên khoảng 720C là nhiệt độ tối hảođể men polymerase chịu nhiệt xúc tácphản ứng tổng hợp bản sao của DNA đíchtheo nguyên tắc bổ sung trên khuôn là cácsợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồibắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp).Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diệncác deoxy nucleoside tri phosphate(dNTP), và chiều của sự tổng hợp là5� � 3� (đoạn mồi) hay 3�� 5�(ssDNA đích)[1,3]. Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, đểhoàn tất thử nghiệm PCR, thường nên cóthêm một giai đoạn gọi là bùthêm (soaking). Giai đoạn này nhiệt độđược giữ 720C trong thời gian tương đốilâu, từ 10 phút đên 1 giờ. Ðây là giai đoạnđể một số các bản sao của DNA đích vìmột lý do nào đó trong các giai đoạn kéodài của các chu kỳ PCR, không kéo dàiđược một các đồng bộ như các bản saokhác, có thể kéo dài hoàn tất nốt chiều dàicủa nó. Trong những chu kỳ nhiệt đầu, sảnphẩm PCR thường có kích thước khôngđều nhau vì chuỗi bổ sung được tổng hợptrên khuôn mẫu của chuỗi đích có trongbệnh phẩm. Càng về sau thì khuôn mẫu đểtổng hợp chuỗi bổ sung chính là các sảnphẩm PCR, nên kích thước của các sảnphẩm PCR rất đều nhau (hình 1).Hình 1 : Nguyên tắc của thử nghiệmPCR. Như vậy từ một số lượng N DNAđích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thửnghiệm PCR đã tổng hợp được N.2n bảnsao. Với một số lượng bản sao, hay còngọi là sản phẩm PCR (PCR product) hayamplicon, lớn như vậy (trên 109 bản saosau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được pháthiện bằng các phương pháp phát hiệnnucleic acid (điện di phát hiện kích thướccủa sản phẩm bằng probe tóm bắt,Southern blot rồi phát hiện sản phẩm). Các thành phần tham gia thửnghiệm PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạyđược, cần phải có đầy đủ các thành phầnsau đây :  DNA hay nuceic acid đích, tức là chuỗi acid nucleic (ví dụ đoạn acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền,. ) mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích. Một trường hợp khác là trong bệnh phẩm có nucleic acid đích, nhưng do bệnh phẩm được sửa soạn không thích hợp hoặc không đúng cách nên nucleic acid đích không bộc lộ ra ; hoặc trong bệnh phẩm hãy còn các chất ức chế phản ứng PCR. Trong những trường hợp này kết quả PCR sẽ âm tính, nhưng là âm tính giả. Vì vậy vấn đề sửa soạn bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh. Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được b ...