Phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - hydroxylase

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. 56 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - hydroxylase được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) kết hợp với giải trình tự gen được sử dụng để phát hiện đột biến.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - hydroxylaseTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCPHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN XÓA ĐOẠN GEN CYP21A2GÂY BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINHTHỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASEVũ Chí Dũng, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, Trần Vân KhánhTrường Đại học Y Hà NộiTăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thểthường gây nên do đột biến gen CYP21A2. Đột biến điểm là loại đột biến phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ khoảng70 - 75%, đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ thấp hơn khoảng 20 - 25%. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu toàndiện nào tiến hành xác định đột biến xóa đoạn trên gen CYP21A2 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩmsinh. Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trên bệnh nhântăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase. 56 bệnh nhân được chẩn đoán xácđịnh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 - hydroxylase được lựa chọn nghiên cứu. Kỹthuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) kết hợp với giải trình tự gen được sử dụngđể phát hiện đột biến. Kết quả cho thấy 14/56 (25%) bệnh nhân đã được phát hiện có đột biến xóa đoạn genCYP21A2, trong đó, 10/14 bệnh nhân có đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3, 1/14 bệnhnhân có đột biến xóa đoạn đồng hợp tử từ gen C4B đến exon 8 gen CYP21A2 và 3 bệnh nhân có đột biếnxóa đoạn dị hợp tử exon 1 - 3 kết hợp với đột biến điểm 656A > G hoặc R356W.Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến xóa đoạn gen CYP21A2, MLPAI. ĐẶT VẤN ĐỀTăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếunày dẫn đến các trình tự ở vùng gen giảenzym 21 - hydroxylase (21 - OH) là bệnh di(CYP21A1P) sẽ chuyển sang gen CYP21A2và dẫn đến các đột biến gây bệnh [3; 4].truyền lặn trên nhiễm sắc thể số 6. Bệnh gâynên do đột biến gen CYP21A2 làm rối loạnquá trình sinh tổng hợp hormon vỏ thượngthận, gây bệnh cảnh lâm sàng là cơn suythượng thận cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậythì sớm giả ở trẻ trai [1, 2].Gen CYP21A2 mã hóa cho 21 - OH nằmtrên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3),gồm 10 exon, có kích thước 3.4 kb. Đột biếngây thiếu hụt 21 - OH là do sự bắt chéo khôngđồng đều giữa các cặp nhiễm sắc thể trongquá trình phân bào giảm nhiễm. Sự bắt chéoCho đến nay, nhiều dạng đột biến đã đượcphát hiện như đột biến điểm, đột biến xóađoạn, trong đó đột biến điểm chiếm tỉ lệ caonhất khoảng 70 - 75%, đột biến xóa đoạnchiếm tỉ lệ thấp hơn khoảng 20 - 25% [4; 5; 6].Kỹ thuật giải trình tự thường được áp dụng đểxác định đột biến điểm gen CYP21A2 [4; 5; 6;9]. Với đột biến xóa đoạn, có nhiều kỹ thuậtxác định, tuy nhiên các phương pháp kinhđiển như PCR thường bị hạn chế về mặt thờigian, kỹ thuật MLPA là kỹ thuật xác định độtbiến xóa đoạn gen CYP21A2 nhanh chóng,Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Gen - Protein,Trường Đại học Y Hà NộiEmail: vankhanh73md@yahoo.comNgày nhận: 16/11/2015Ngày được chấp thuận: 26/02/20168chính xác và đang được ứng dụng rộng rãi [7,8]. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Xácđịnh đột biến xóa đoạn gen CYP21A2 trênbệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thểthiếu hụt enzym 21-hydroxylase.TCNCYH 99 (1) - 2016TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Đối tượng: 56 bệnh nhân tăng sảnthượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 -2oC trước khi cho 3µl hỗn hợp chứa các đoạnoligonucleotid của các probe. Hỗn hợp được ủở 60oC trong 16 giờ. Thêm 32µl hỗn hợphydroxylase được chẩn đoán và điều trị tạiligase buffer, ủ ở 54oC trong 15 phút. Tăngnhiệt độ lên 98oC trong 5 phút, giữ ở 4oC.Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnhviện Nhi Trung ương.Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10µl sảnphẩm lai vào 30µl hỗn hợp PCR buffer, giữ ởTiêu chuẩn chẩn đoánBệnh nhân có biểu hiện mất muối, mấtnước từ nhẹ đến nặng, Na+ giảm và K+ tăng;Biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái vàdậy thì sớm ở trẻ trai. Nồng độ 17 - OH tăngtrên 10.000 ng/dl ở thể cổ điển và tăng từ 20010.000 ng/dl ở thể không cổ điển [2].2. Phương pháp2.1. Kỹ thuật tách chiết DNADNA được tách chiết từ bạch cầu máungoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tấtcả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồngđộ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị1,8-2,0 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và đượcsử dụng để phân tích.2.2. Kỹ thuật MLPASử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland). Thành phần của kit gồm các đầu dò60oC trước khi thêm 10µl hỗn hợp PCRmaster vào hỗn hợp, thực hiện chu trình nhiệtsau: [95oC - 30 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 1phút] x 35 chu kỳ; 72oC - 20 phút; bảo quản ở4oC. Điện di mao quản huỳnh quang trên máygiải trình tự để phân tích kết quả. Nếu có độtbiến xóa đoạn, probe không gắn được vàogen đích, do đó kết quả điện di sẽ không xuấthiện đỉnh tương ứng tại exon đột biến. Độtbiến dị hợp tử thì chiều cao đỉnh sẽ bằng 1/2so với mẫu đối chứng.3. Kỹ thuật giải trình tự gen: được tiếnhành ...