Phát hiện gene bản thể OXA-51-Like của Acinetobacter baumannii bằng phương pháp real-time PCR

Nghiên cứu này nhắm đến khả năng phát hiện nhanh nhóm gen OXA-51-like, là gen bản thể đặc trưng của vi khuẩn A. baumannii bằng real-time PCR. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện ngắn, trong khoảng 3÷4 h, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, không cần bước điện di sản phẩm PCR, hạn chế ngoại nhiễm, đỡ tốn thời gian khi thực hiện quy trình kỹ thuật, khả năng thực hiện nhiều mẫu cùng một lúc.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát hiện gene bản thể OXA-51-Like của Acinetobacter baumannii bằng phương pháp real-time PCRNghiên cứu khoa học công nghệ PHÁT HIỆN GENE BẢN THỂ OXA-51-LIKE CỦA Acinetobacter baumannii BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR (1) (2) (1) NGUYỄN VĂN HIỆP , NGUYỄN TUẤN ANH , NGUYỄN PHƯƠNG NAM 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Acinetobacter baumannii là một trong các chủng Acinetobacter spp. có cấutrúc của một cầu - trực khuẩn Gram âm, có nguồn gốc từ thiên nhiên (đất, nước) vớitính chất sinh học thay đổi tùy theo điều kiện và môi trường sống, giúp vi khuẩn cóthể tồn tại lâu trong môi trường, đặc biệt ở các dụng cụ y tế dùng chăm sóc và điềutrị bệnh nhân của bệnh viện. Acinetobacter baumannii có đặc tính sinh học rất đặcbiệt là có khả năng tạo màng sinh học biofilm, nhờ khả năng bám dính của màngsinh học biofilm, giúp vi khuẩn gắn chặt vào bề mặt dụng cụ, môi trường và tạo điềukiện cho vi khuẩn dễ dàng tồn tại lâu dài, thu nhận, tích lũy gen kháng kháng sinh vàtrở thành tác nhân gây khó khăn trong điều trị và kiểm soát lây nhiễm [1÷4]. Có nhiều loài Acinetobacter và tất cả chúng đều có khả năng gây bệnh cho người,trong đó A. baumannii chiếm hơn 80% trường hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộcAcinetobacter spp. A. baumannii có thể gây nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng máu,viêm phổi, viêm đường niệu, viêm màng não và hay kèm theo sốc nhiễm khuẩn... Sựnguy hiểm khi nhiễm A. baumannii ở chỗ hiện nay vi khuẩn này có khả năng kháng lạihầu hết các loại kháng sinh như β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem),tetracycline, aminoglycoside, fluoroquinolone… Điều này khiến nó trở thành loại vikhuẩn siêu kháng thuốc, đặc biệt nguy hiểm cho những bệnh nhân nằm viện lâu ngày,phải dùng các biện pháp can thiệp như ống thở hay kim truyền liên tục, dùng quá nhiềukháng sinh hoặc bị suy giảm miễn dịch. Vì vậy, việc chẩn đoán chính xác bệnh nhânnhiễm A. baumannii là rất cần thiết để kịp thời điều trị [5, 6]. Hiện nay, phương pháp phát hiện A. baumannii chủ yếu là phương pháp nuôicấy truyền thống vì A. baumannii rất dễ nuôi cấy. Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp này là phải mất ít nhất 1 ngày để phân lập, định danh vi khuẩn. Hình thái (quengắn, nhầy) và đặc tính khó tẩy màu làm nó dễ bị định danh nhầm với các vi khuẩnGram (-) và (+) hình cầu khác. Và hệ vi khuẩn A. Calcoaceticus - A. baumannii lạigiống với Enterobacteriaceae khi nuôi cấy qua đêm đều có đường kính khuẩn lạc từ1,5÷3,0 mm. Hơn nữa, chưa có phản ứng sinh hóa biến dưỡng đặc trưng có thể giúpphân biệt Acinetobacter với các vi khuẩn Gram (-) không lên men khác [7, 8]. Một trong những gen kháng kháng sinh của A. baumannii có khả năng khángvới nhiều loại kháng sinh khác nhau và kháng với cả carbapenem đặc trị cho chúngđược biết đến là gen Oxacilinase (OXA). Các gen này thường được mã hóa trênplasmid và nhiễm sắc thể giúp A. baumannii có khả năng kháng nhiều loại thuốc, lâylan và gây dịch [1÷4]. Nghiên cứu này nhắm đến khả năng phát hiện nhanh nhóm gen OXA-51-like, làgen bản thể đặc trưng của vi khuẩn A. baumannii bằng real-time PCR. Ưu điểm củaphương pháp này là thời gian thực hiện ngắn, trong khoảng 3÷4 h, có độ nhạy và độ đặchiệu cao, không cần bước điện di sản phẩm PCR, hạn chế ngoại nhiễm, đỡ tốn thời giankhi thực hiện quy trình kỹ thuật, khả năng thực hiện nhiều mẫu cùng một lúc.Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 11, 12 - 2016 35 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2. MỤC ĐÍCH, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục đích Xây dựng thành công quy trình real-time PCR (multyplex) sử dụng màu huỳnh quangEvaGreen để phát hiện nhanh gene bản thể OXA-51-like của Acinetobacter baumannii. 2.2. Vật liệu Chủng vi khuẩn A. baumannii (ATCC 19606) và các mẫu DNA / vi khuẩnA. baumannii được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân điều trị ở một số bệnhviện, được lưu giữ tại Phân môn Sinh học phân tử, Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điềudưỡng Kỹ thuật Y học, Đại học Y dược TP. HCM. Các cặp mồi đặc hiệu cho gene OXA-51-like của A. baumannii và gene 16SrRNA của Acinetobacter spp. đã được công bố trước đây [2]. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA của A. baumannii Khuẩn lạc đơn, đặc trưng của A. baumannii được thu nhận và tăng sinh trongmôi trường Luria-Bertani ở điều kiện 37oC trong 16 ÷ 24 giờ. Sau khi kết thúc tăng sinh, DNA tổng số của A. baumannii được tách chiếttheo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết“DNA column-based extraction kit” (Khoa Thương). Tất cả mọi thao tác đều đượcthực hiện theo đúng hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất. Sản phẩm DNA sautách chiết được đánh giá chất lượng bằng phương pháp quang phổ. Giá trị OD260/280từ 1,6 ÷ 1,8 được chấp nhận là đủ tiêu ...