Phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng taqman probe cải tiến để phát hiện HPV nguy cơ thấp type 6 và 11 với độ đặc hiệu và độ nhạy cao

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúp phát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Human papillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiện gen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng taqman probe cải tiến để phát hiện HPV nguy cơ thấp type 6 và 11 với độ đặc hiệu và độ nhạy caoTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCPHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR SỬ DỤNGTAQMAN PROBE CẢI TIẾN ĐỂ PHÁT HIỆN HPV NGUY CƠ THẤPTYPE 6 VÀ 11 VỚI ĐỘ ĐẶC HIỆU VÀ ĐỘ NHẠY CAOTrần Thị Ngọc Ánh1,2#, Ngô Thị Hồng1,2,3#, Chu Văn Sơn1,Trần Dụ Chi4,5, Bùi Thị Việt Hà1,2, Nguyễn Thị Vân Anh1**Tác giả liên hệ; #:Đồng tác giả thứ nhấtPhòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,1Đại học Quốc gia Hà Nội; 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội3Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, Thành phố Bắc Ninh4Bệnh viện Da liễu Trung ương; 5Bệnh viện Đa khoa Quốc tế VinmecHuman papillomavirus (HPV) là tác nhân gây bệnh phổ biến lây nhiễm qua đường tình dục, gồm nhiềusub-type được phân thành nhóm nguy cơ cao gây ung thư và nhóm nguy cơ thấp gây các bệnh lý về da vàniêm mạc với tỷ lệ nhiễm và khả năng tái phát cao. Trên thị trường đã có sinh phẩm nhập ngoại để phát hiệnmột số type Human papillomavirus nguy cơ thấp, tuy nhiên giá thành cao nên khó triển khai thành kít sànglọc trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúpphát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Humanpapillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụngTaqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiệngen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe. Kết quả so sánh trên 30 mẫu dịch âm đạo với sinhphẩm thương mại có uy tín cho kết quả tương đồng về tỷ lệ mẫu dương tính và chu kỳ ngưỡng phát hiệnHuman papillomavirus 6/11.Từ khoá: HPV, nguy cơ thấp, real time PCR Taqman, dịch âm đạoI. ĐẶT VẤN ĐỀHuman papiloma virus (HPV) là một trongnhững tác nhân gây bệnh quan trọng lâynhiễm qua đường tình dục ở cả nam và nữtrên toàn thế giới và được cho là bệnh truyềnnhiễm qua đường tình dục phổ biến nhất ởHoa Kỳ [1]. Các type Human papillomavirus16 và 18 và 12 type khác như 31, 33, 35, 39,45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 đã được nghiêncứu và chứng minh có nguy cơ cao gây bệnhung thư cổ tử cung [2,3,4]. Ngoài các type cónguy cơ cao, một số type nguy cơ thấp đượcĐịa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Vân Anh, Trường Đại họcKhoa học Tự nhiêncông nhận là nguyên nhân gây ra các tổnthương lành tính trên da (mụn cơm, mụn cócthông thường, mụn cơm phẳng). Hai typeHPV nguy cơ thấp 6 và 11 là nguyên nhâncủa 90% các bệnh lý về da [5]. Nhiễm trùngpapillomatosis chủ yếu gặp ở trẻ nhỏ đượcsinh ra từ những bà mẹ có tiền sử nhiễm HPVtrong giai đoạn chu sinh [6 - 8]. Những tổnthương này có thể chuyển đổi thành ác tính[9]. Nhiễm trùng HPV thường không biểu hiệnlâm sàng nên không thể có thống kê chính xácsố lượng người nhiễm trên toàn thế giới. Ướctính trên thế giới, hàng năm, HPV gây ra mụncóc sinh dục cho 0,1 - 0,2% dân số, chủ yếu ởEmail: vananhbiolab@gmail.comtuổi vị thành niên, thanh thiếu niên [10]. CácNgày nhận: 30/7/2018type này rất dễ lây truyền qua tiếp xúc (da,Ngày được chấp thuận: 04/9/2018niêm mạc, dịch tiết có virus). Do đó, việc chẩnTCNCYH 115 (6) - 201861TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCđoán sàng lọc tại cộng đồng HPV 6 và 11VNĐ/ phản ứng) nên khó khăn khi triển khaicũng góp phần quan trọng để phòng tránh lâythành xét nghiệm sàng lọc tại cộng đồng. Ởnhiễm, đặc biệt là cho trẻ sơ sinh. Hiện nay,trong nước, chúng tôi chưa tìm thấy thông tinphương pháp hiệu quả nhất để chẩn đoánvề nghiên cứu phát triển phương pháp hay bộHPV là dựa vào vật liệu di truyền (kỹ thuậtsinh phẩm phát hiện các type HPV nguy cơPCR/real time PCR). Trên thế giới, đã có côngthấp mà mới chỉ có thông tin về các bộ sinhbố của một vài tác giả về phát triển kỹ thuậtphẩm phát hiện các type HPV nguy cơ cao.multiplex real time PCR để phát hiện đồngDo vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặtthời một số type nguy cơ cao và nguy cơ thấpmục tiêu bước đầu phát triển phương pháptrong sàng lọc HPV ở các mẫu dịch âm đạo.multiplex real time PCR sử dụng TaqmanĐiển hình là công bố của tác giả Lindh vàprobe cải tiến gắn thêm ZEN quencher đểcộng sự (2007) về phát hiện 12 type HPVphát hiện 2 type HPV nguy cơ thấp thườngnguy cơ cao và 2 type nguy cơ thấp HPV 6/11gặp nhất là HPV 6 và HPV 11 có độ đặc hiệuđồng thời trên cùng một chu trình nhiệt [11].100% và độ nhạy đạt tới ≤ 5 copy phản ứngTuy nhiên, hạn chế của nghiên cứu là sử25 µL. Kết quả của nghiên cứu là tiền đề chodụng Taqman probe thông thường có huỳnhviệc phát triển phương pháp phát hiện đồngquang TAMRA ở đầu 3’ nên tín hiệu nền cònthời các type HPV nguy cơ cao và nguy cơcao và chưa tối ưu được master mix để phátthấp trong tương lai, hướng tới việc chế tạohiện của 14 type trong cùng 1 ống phản ứngbộ sinh phẩm có chất lượng tương đương vàmà vẫn phải thực hiện 14 ống phản ứng riênggiá thành cạnh tranh so với bộ sinh phẩmrẽ cho mỗi mẫu. Một hạn chế khác là chưa cóthương mại có uy tín trên thị trường. Nhờ đó,thông tin tối ưu về độ nhạy và độ đặc hiệu củagóp phần tầm soát tỷ lệ nhiễm HPV và đánhphản ứng. Nghiên cứu của tác giả Seaman vàgiá hiệu quả vacxin.cộng sự (2010) có cải tiến hơn trong việc pháttriển được kỹ thuật multiplex real time PCRphát hiện đồng thời HPV 16, 18 và 2 type HPVnguy cơ thấp 6, 11 [12]. Tuy nhiên, độ nhạycủa ngưỡng phát hiện chỉ đạt 103 copy/phảnứng 25 µL, một phần do sử dụng TaqmanII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Đối tượngMẫu tham chiếu dùng để xây dựngphương pháp:probe thông thường có BHQ1 quencher ở đầu+ Mẫu HPV: các mẫu DNA được tinh sạch3’. Tác giả Yu và cộng sự (năm 2012) đã sửvà xác định dương tính với các HPVdụng probe huỳnh quang AllGlo để phát hiệngenotypes khác nhau. Trong đó có 14 typeđồng thời 4 type HPV ...