Phương pháp định lượng vi khuẩn

Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nmGram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Phương pháp định lượng vi khuẩn3.1: Cơ sở lý luận của phương pháp cố địnhtiêu bản và nhuộm tế bào: Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển viquang học là phương pháp không thể thiếuđược trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.Thành tế bào (Cell wall) Thành tế bào còn gọi là vách tế bào, chiếm 10-40% trọng lượng khô của tế bào, độ dày thành tế bào vi khuẩn Gram âm là 10 nm Gram dương là 14-18 nm. Thành tế bào là lớp cấu trúc ngoài cùng, có độ rắn chắc nhất định để duy trì hình dạng tế bào, có khả năng bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bất lợi.Nồng độ đường muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào (áp suất thẩm thấu tương đương với dung dịch glucose 10-20%) do đó tế bào hấp thu khá nhiều nước từ bên ngoài vào. Nếu không có thành tế bào vững chắc thì tế bào sẽ bị phá vỡ. Thành tế bào vi khuẩn G- và G+ có sự sai khác về thành phần cấu tạo như sau: Thànhphần Tỷlệ%đốivớikhốilượngkhôcủa Th thànhtếbàovikhuẩn G+ GPeptidoglycan 3095 520Acidteicoic Có 0Lipid Hầunhưkhông 20Protein Ohoặcít CaoVách vi khuẩn Gram dương có thành phần cấutạo cơ bản là pepidoglycan (PG) hoặc còn gọi làglucopeptit, murein,...chiếm 95 % trọng lượng khôcủa thành, tạo ra một màng polime xốp, không hòatan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạnglưới. Cấu trúc của PG gồm 3 thành phần: N-acetylglucozamin, N-acetylmuramic vàgalactozamin. Thành tế bào vi khuẩn Gram dươngchứa PG đầy đủ 4 lớp (chiếm >50% trọng lượngkhô của thành). Ngoài ra còn thấy thành phần acidteichoic (là các polime của glycerol và ribitolphotphat), gắn với PG hay màng tế bào.Vách vi khuẩn Gram âm có thành tế bào với cấu trúc phức tạp, ngoài cùng là 2 lớp lipopolysaccharit có đan xen với các phân tử protein. Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, chất kháng sinh, muối kim loại nặng, một số enzym phân giải…)Tính chất nhuộm màu của vsv là khả năng của chúng có thể giữ lại các chất có màu (thuốc nhuộm). Tính chất đó có mối liên hệ chặt chẽ với thành phần hoá học và các tính chất hoá-lý. Màu và khả năng của các chất nhuộm (chromogene) được xác định bởi các nhóm hữu cơ trong phân tử của nó. Các nhóm này tham gia vào các mối liên kết hoá học với các gốc khác nhau trong thành phần hoá học của vsv và được giữ lại, biến đổi màu của vsv. Các chromogene khi phân cực và tạo thành các cation hay anion có màu. Trong thực tế vsv học người ta sử dụng fucsin, Crystal violet, Xanh metylen… tham gia nhuộm màu là các nhóm amin. Trong các thuốc nhuộm khác, tính chất này được thực hiện bởi các nhóm OH-Khi vsv có chứa các phức chất của protein, nucleoproteid có tính acid, vsv bắt màu mạnh với thuốc nhuộm có tính kiềm. Chính vì vậy, vsv trong giai đoạn phát triển, với hàm lượng nucleoproteid cao rất dễ bắt màu.Các tế bào sống bắt màu yếu, vì các dung dịch có màu khó đi qua thành tế bào. Đó là lý do t ại sao người ta thường tiêu diệt vsv và cố định tiêu bản bằng nhiệt hoặc hoá chất.Các bào tử của vsv, đặc biệt là của một số vi khuẩn rất khó nhuộm màu. Người ta phải nung nóng tiêu bản và sử dụng thuốc nhuộm ở nồng độ cao (đậm đặc hơn).Nguyên tắc nhuộm Gram : - Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.3.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vsv có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản. Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có ion mang màu là các cation (mang điện tíchdương). Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặtngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình hấpthu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh vậtđược nhuộm. Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màuchỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loạithuốc nhuộm thường dùng là methylene blue,crystal violet, fuchsin...+Phương pháp nhuộm Gram Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước: -Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể ...