Primer

Phần định nghĩa và thảo luận dưới đây chỉ đúng cho thuật ngữ primer dùng trong sinh học phân tử. Primer (còn có tên gọi khác là đoạn mồi) là một sợi nucleic acid (hoặc ribonucleic acid) dùng để làm đoạn khởi đầu cho quá trình nhân đôi của DNA.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Primer Primer Phần định nghĩa và thảo luận dưới đây chỉ đúng cho thuật ngữ primer dùng trong sinh học phân tử.Primer (còn có tên gọi kháclà đoạn mồi) là một sợi nucleicacid (hoặc ribonucleic acid) dùngđể làm đoạn khởi đầu cho quátrình nhân đôi của DNA. Hầu hếtcác DNApolymerase (enzyme xúc tác quátrình nhân đôi DNA) không thểbắt đầu tổng hợp một đoạn DNAmới mà thiếu primer. Vì nó chỉgắn các nucleotide vào sợi primercó sẵn theo nguyên tắc bổsung với sợi khuôn.Trong hầu hết các quá trình saochép DNA tự nhiên, mồi cơ bảncho việc tổng hợp DNA là sợiRNA ngắn. RNA này được tạo rabởi RNA polymerase, nó đượcloại bỏ đi và được thay thế bằngDNA bởi DNA polymerase.Nhiều kỹ thuật sinh học phântử liên quan đến DNApolymerase, như kỹ thuật xácđịnh trình tự DNA và PCR, cầnđến mồi. Mồi dùng cho các kỹthuật này thường ngắn (khoảng 20base), là các phân tử DNA đượctổng hợp nhân tạo. Cấu trúc thậtsự của các mồi này bắt đầu bằngcác 3-hydroxyl nucleoside gắnvới một cái gọi là CPG(controlled-pore glass). Đầu 5-hydroxyl của nucleosideđược dimethoxytrityl (DMT) baophủ nhằm ngăn sự thành lập chuỗinucleotide. để thêm vào 1nucleotide thì phải loại bỏ DMTtheo cách hóa học, và 1 nucleotideđược thêm vào. Đầu 5-hydroxylcủa nucleotide mới bị khóa lại bởiDMT nhằm ngăn chặn sự gắnthêm vào 1 hay nhiều nucleotidetrên 1 chuỗi. Sau đó, chu trìnhđược lặo lại đối với mỗinucleotide bằng 1 mồi. Đây chỉ làmô tả đơn giản, còn quy trìnhthực tế thì khá phức tạp. Vì thế,hầu hết các phòng thí nghiệm đềukhông tạo mồi trên chính nó.Việc xác định trình tự DNA đượcdùng để xác định nucleotide trongsợi DNA. Phương pháp xác địnhtrình tự được gọi là xác định trìnhtự dideoxy (hay còn gọilà phương pháp Sanger) dùng mồilàm marker khởi đầu cho phảnứng chuỗi.Trong PCR, mồi được dùng đểxác định các phân đoạn DNA màđược khuyếch đại bởi PCR. Chiềudài của mồi thường không dài hơn50 nucleotide (Do DNA thường làsợi đôi, nên chiều dài của nó đượcđo bằng cặp base. Chiều dài củaDNA sợi đơn được đo bằng basehay nucleotide), và chùng kết hợpchính xác khởi đầu và kết thúcphân đoạn DNA để được khuyếchđại. Chúng anneal(adhere) khuônDNA ở điểm khởi đầu và kếtthúc, tại đó DNA polymerase gắnvà bắt đầu tổng hợp sợi DNAmới.Việc lựa chọn chiều dài mồi vànhiệt độ nóng chảy của chúng dựavào một số lý do. Nhiệt độ nóngchảy của mồi được định nghĩa lànhiệt độ thấp hơn nhiệt độ củamồi mà sẽ anneal khuôn DNA vàcao hơn nhiệt độ làm mồi rời khỏikhuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảycần tăng lên theo độ dài của mồi.Mồi quá ngắn sẽ làm anneal mộtsố vị trí trên khuôn DNA dài, dẫnđến các bản sao không đặc hiệu.Nói cách khác, chiều dài của mồibị giới hạn bởi nhiệt độ làm nóngchảy nó. Nhiệt độ nóng chảy quácao, nghĩa là trên 80 °C, có thểgây ra một số vấn đề do DNApoluymerase ít hoạt động ở nhiệtđộ này. Chiều dài tối ưu của mồivào khoảng 30 đến 40 nucleotidevới nhiệt độ nóng chảy vàokhoảng 60 °C đến 75 °C. Có mộtsố cách để tính nhệit độ nóngchảy (TM) của mồi. (A, G, C và Ttương ứng là số nucleotide củamồi. [Na+] là nồng độ Na+ trongPCR)Phương pháp GC: Nhanh vàđơn giản, với mồi dài trên 13nucleotide.Phương pháp điều chỉnh bằngmuối: chính xác hơn GC, vớimồi dài hơn 13 nucleotide.Base-stacking calculation :chính xác nhất, nhưng phức tạptrong đóΔH là enthalpy của tương tác basestacking điều chỉnh cho các nhântố khởi đầu vòng xoắn (helix)ΔS là entropy của base stackingđiều chỉnh cho các nhân tố khởiđầu helix và điều chỉnh nồng độmuối cho emtropyR is the universal gasconstantCũng vậy, mồi không anneal dễdàng với chính nó và những cáicùng loại với nó, thành lập nêncác loop hoặc kẹp tóc trong quytrình. Điều này làm cản trở việcanneal khuôn DNA. Tuy nhiên,càc kẹp tóc nhỏ thường không thểtránh khỏi.Đôi khi cũng sử dụng mồi phângiải. Các mồi này là một hỗn hợpmồi giống nhau, nhưng chưa xácđịnh. Chúng có thể thích hợpnếu gene giống nhau đượckhuyếch đại từ các sinh vật khácnhau. Có các cách sử dụng khácđối với mồi phân giải là khi mồithiết kế dựa vào trình tự protein.Một số codon khác nhau có thểmã hóa cho một amino acid. Vìvậy trình tự của mồi tương ứngvới amino acid isoleucine có thểlà ATH, trong đó A thaycho adenine, T cho thymine, vàH adenine, thymine,hoặc cytosine. (Xem mã ditruyền trong các bài sau nàyvề codon) Sử dụng mồi phân giảicó thể làm giảm tính đặc hiệu củaquá trình khuyếch đại PCE. Vấnđề có thể được giải quyết từngphần bằng cách sửdụng touchdown PCR.ReferencesAn earlier version of the abovearticle was posted on Nupedia.Primer (còn có tên gọi khác làđoạn mồi) là một sợi nucleic acid(hoặc ribonucleic acid) dùng đểlàm đoạn khởi đầu cho quá trìnhnhân đôi của DNA. Hầu hết cácDNA polymerase (enzyme xúctác quá trình nhân đôi DNA)không thể bắt đầu tổng hợp mộtđoạn DNA mới mà thiếu primer.Vì nó chỉ gắn các nucleotide vàosợi primer có sẵn theo nguyên tắcbổ sung với sợi khuôn.Trong quá trình ...