Quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens HB

Từ bộ sưu tập vi khuẩn Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB được phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP 16, chủng HB có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin và enzyme ngoại bào protease, chitinase cao nhất được chọn để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Xử lý formalin 0.5%, 30 phút dịch nuôi cấy Serratia marccescens HB trong môi trường peptone glycerol tiêu diệt hoàn toàn tế bào mà ít ảnh hưởng nhất lên nồng độ prodigiosin, cũng như hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase. Mời các bạn cùng tham khảo!
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia Marcescens HB QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS HB Nguyễn Hoài Hƣơng, Hồ Trung Lộc, Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng, Võ Đình Chiến Viện Khoa học Ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH) TÓM TẮT Từ bộ sưu tập vi khuẩn Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB được phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP 16, chủng HB có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin và enzyme ngoại bào protease, chitinase cao nhất được chọn để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Xử lý formalin 0.5%, 30 phút dịch nuôi cấy Serratia marccescens HB trong môi trường peptone glycerol tiêu diệt hoàn toàn tế bào mà ít ảnh hưởng nhất lên nồng độ prodigiosin, cũng như hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase. Chế phẩm được tạo thành từ dịch nuôi cấy xử lý như trên pha loãng 104 lần có bổ sung 0,04 % Tween 80, 0,2 % rỉ đường và 0,2% CMC trong điều kiện trong tối có khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura 100% sau 96 giờ. Chế phẩm bảo quản dưới nắng 5 ngày làm giảm hiệu lực diệt sâu xuống còn 80% sau sau 120 giờ. Từ khóa: Formalin, hiệu lực diệt sâu, prodigiosin, Serratia marcescens, sâu khoang ăn tạp. 1. GIỚI THIỆU Prodigiosin là một hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi các vi khuẩn khác nhau, trong đó có các chủng Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng gây bệnh côn trùng (EPN) Steinernema guangdongsenxe XT và Heterorhabditis indica CP 16. Các chủng S. marcescens SS1 và S. marcescens SH1 đã chứng tỏ có khả năng diệt sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura và Spodoptera exigua rất mạnh [1,2]. Dịch nuôi cấy chủng S. marcescens SH4 khi pha loãng 104 lần cũng thể hiện hoạt tính diệt sâu tơ Plutella xylostella 100% sau 96 giờ tương tự như thuốc trừ sâu sinh học Reagant 3.6EC chứa abamectin. Tác nhân gây chết sâu ngoài prodigiosin còn có các enzyme ngoại bào như protease, chitinase và các sản phẩm ngoại bào khác, hứa hẹn có thể phát triển thuốc trừ sâu trực tiếp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bỏ qua quá trình thu hồi và tinh sạch prodigiosin. Để hạn chế ảnh hưởng bất lợi của vi khuẩn sống khi sử dụng làm chế phẩm sinh học, phương pháp tieu diệt tế bào mà không ảnh hưởng lên hoạt chất cũng là một vấn đề được quan tâm. Đó là cũng là mục tiêu của nghiên cứu này khai thác bộ sưu tập các chủng Serratia marcescens đã phân lập, tuyển chọn chủng có khả năng vượt trội để sản xuất chế phẩm diệt sâu và xác định phương pháp tiêu diệt tế bào thích hợp cho chủng. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Vi khuẩn Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB và HB được phân lập, định danh theo nghiên cứu trước đó [1]. 721 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Chọn lọc chủng sản xuất chế phẩm Thu dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB và HB được tăng sinh trong môi trường peptone glycerol broth (PG), tỉ lệ cấy giống 1%, nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong 48 giờ. Sau nuôi cấy ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút thu tế bào, trích ly prodigiosin bằng dung môi EtOH: HCl 1N:với tỷ lệ nồng độ theo thể tích là 95:5 (v:v), cuối cùng ly tâm lần 2 thu dịch màu, bỏ tế bào. Quét phổ hấp thụ UV-VIS ở bước sóng 380 - 700 nm lần lượt đối với dịch nuôi cấy sau lên men và dịch trong sau trích ly. Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase của chúng trên môi trường thạch gelatin agar và chitin agar theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, thời gian ủ là 24 giờ ở nhiệt độ phòng, phát hiện bằng cách tráng đĩa bằng dung dịch TCA 10% đối với thạch gelatin và dung dịch Lugol đối với thạch chitin. 2.2.2. Xử lý dịch nuôi cấy tiêu diệt tế bào Dịch nuôi cấy sau lên men được xử lý acid HCl 1N về pH 2 trong 24 giờ, sau đó trung hòa bằng NaOH về pH 7 [2] hoặc xử lý nhiệt ở 650C và 1000C trong 15 phút [3], hoặc bổ sung dung dịch formalin 0,125%, 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1% trong 30 phút. Sau khi được xử lý, dịch nuôi cấy đem ria lại trên thạch peptone glycerol agar (PGA), ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng để kiểm tra sự sống sót của tế bào. Prodigiosin sau xử lý được so sánh với prodigiosin sau xử lý bằng qua đo mật độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại. Hoạt tính enzyme protease, chitinase của dịch nuôi cấy sau xử lý được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch. 2.2.3. Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau lên men 48 giờ được xử lý theo công thức chọn được từ thí nghiệm mô tả ở mục 2.2.2, pha loãng 104 lần [1], phối trộn phụ gia và thiết lập điều kiện bảo quản trước khi thí nghiệm 5 ngày như trình bày trong bảng 1. Trứng sâu khoang Spodoptera litura ấp cho nở, sâu được nuôi bằng lá thầu dầu cho đến tuổi 3 cho thí nghiệm. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi 3 và 3 lá thầu dầu (kích thước mỗi lá là 15000 mm2) được quét lên bề mặt mỗi lá 100 μl dịch nuôi cấy chuẩn bị như trên. Mẫu đối chứng âm quét lá bằ ...