So sánh hai phương pháp tổng hợp gen caf1 mã hóa kháng nguyên vỏ F1 của vi khuẩn Yersina pestis

Trong nghiên cứu này, hai phương pháp tổng hợp gen caf1, mã hóa kháng nguyên F1,nhằm biểu hiệu trong tế bào E. coli được trình bày. Sau khi tối ưu trình tự mã bộ ba cho sự biểu hiện trong tế bào vật chủ E. coli, các đoạn oligos ngắn được thiết kế và tổng hợp, gen caf1 được tổng hợp nhân tạo bằng hai phương pháp: “gapless” PCR và TBIO.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
So sánh hai phương pháp tổng hợp gen caf1 mã hóa kháng nguyên vỏ F1 của vi khuẩn Yersina pestis Hóa học & Kỹ thuật môi trường SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP GEN caf1 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VỎ F1 CỦA VI KHUẨN Yersina pestis Nguyễn Phượng Minh1*, Lê Trọng Tài1, Ngô Ngọc Trung1, Nguyễn Ngọc Hưng2 Tóm tắt: Với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, việc tổng hợp một trình tự DNA có trình tự mong muốn đang ngày càng tăng lên và dễ dàng hơn. Tuy nhiên một số trình tự gen độc, có tính nguy hiểm có thể không được tổng hợp do liên quan đến vấn đề an toàn. Vì vậy việc chủ động tổng hợp được các trình tự gen mong muốn sẽ có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu, chủ động được thời gian và công việc. Trong nghiên cứu này, hai phương pháp tổng hợpgen caf1, mã hóa kháng nguyên F1,nhằm biểu hiệu trong tế bào E. coli được trình bày. Sau khi tối ưu trình tựmã bộ ba cho sự biểu hiện trong tế bào vật chủ E. coli, các đoạn oligos ngắn được thiết kế và tổng hợp, gen caf1được tổng hợp nhân tạo bằng hai phương pháp: “gapless” PCR và TBIO. Tiếp đó, trình tự gen đã tổng hợp được đưa vào vector tách dòng pJET1.2/blunt để kiểm tra khả năng tổng hợp và so sánh giữa hai phương pháp.Trình tự gen đúng được biểu hiện trong tế bàoE. coli. Kết quả giải trình tự cho thấy phương pháp này cho phép tổng hợp được trình tự gen mục tiêu với độ chính xác là 2/6 dòng plasmid. Trình tự gen này đã được đưa vào vector pET-22b(+) và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3) ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)10. Các kết quả điện di protein SDS-PAGE, tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Nikelvà Western blot cho thấy kháng nguyên tái tổ hợp F1 đã được tạo ra thành công ở dạng tan trong tế bào E. coli. Từ khóa: Kháng nguyên F1; Tổng hợp gen; Gen caf1. 1. MỞ ĐẦU Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tiến triển cấp tính, cực nguy hiểm do vi khuẩn Yersinia pestis gây ra. Bệnh lưu hành trong quần thể một số loài động vật gặm nhấm (chủ yếu là chuột) và bọ chét ký sinh trên chúng rồi từ đó lây truyền sang người qua trung gian bọ chét nhiễm khuẩn. Trong lịch sử loài người được ghi nhận cho đến nay, dịch hạch là loại bệnh truyền nhiễm với số ca tử vong cao nhất (khoảng 200 triệu ca) (Perry, Fetherston, 1997). Hiện nay, bệnh dịch hạch vẫn đang lưu hành rải rác tại một số quốc gia trên thế giới. Trong những năm gần đây, tại Việt Nam không ghi nhận trường hợp nào mắc bệnh dịch hạch. Tuy nhiên, nguy cơ lây lan bệnh dịch hạch từ nước ngoài vào Việt Nam là rất lớn (Bộ Y tế, 2014). Mặt khác, Y. pestis còn có thể được sử dụng như vũ khí sinh học với tính hủy diệt rất lớn, gây lo ngại cho cộng đồng quốc tế đặc biệt trong thời điểm hiện nay khi các vụ khủng bố liên tiếp diễn ra trên thế giới (CDC, 2017). Về tác nhân gây bệnh, Y. pestis là trực khuẩn, Gram âm, không di động, không hình thành bào tử thuộc họ Enterobacteriaceae. Sau khi nhiễm vào cơ thể, Y. pestis tiết ra một protein nang được gọi là kháng nguyên F1, chỉ có ở Y. pestis. Do vậy, kháng nguyên này thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh dịch hạch hay phát hiện Y. pestis trong môi trường. Ở Y. pestis, quá trình tổng hợp và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M, caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon (Zhou et al., 2006). Về mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là một chuỗi polypeptide bao gồm 170 axít amin, khối lượng phân tử từ 17-17,6 kDa, điểm đẳng điện 4,1 - 4,4 (Andrews et al., 1996; Galyov et al., 1990). Kháng nguyên F1 là một protein có tính kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β (Andrews et al., 1996; Galyov et al., 1990). 90 N. P. Minh, …, N. N. Hưng, “So sánh hai phương pháp tổng hợp gen … Yersina pestis.” Nghiên cứu khoa học công nghệ Kĩ thuật tổng hợp oligonucleotides được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 và đầu những năm 1970 khi thực hiện thành công với gen của enzyme tRNA (Wittig B and Wittig S, 1978). Ngày nay, bằng kĩ thuật PCR có rất nhiều các phương pháp tổng hợp gen được ứng dụng (Ai-Sheng Xiong et al., 2008).Các phương pháp tổng hợp gen đã được miêu tả như sự gắn của hai đôi của các đoạn oligos dựa vào liên kết phosphoryl (Scarpullaet al., 1982; Gupta et al., 1968), phương pháp Fok I (Mandecki and Bolling, 1988) và sửa cấu trúc của chuỗi phản ứng nối cho tổng hợp gen. Nhằm tạo kháng nguyên F1 làm nguyên liệu để chẩn đoán bệnh dịch hạch, nhiều nghiên cứu đã biểu hiện protein kháng nguyên này trong tế bào E. coli (Andrews et al., 1996; Erova et al., 2013; Tsui et al., 2015). Cách tiếp cận được sử dụng phổ biến là biểu hiện toàn bộ operon trong E. coli để tạo kháng nguyên F1 ở dạng ngoại bào tương tự như ở Y. pestis (Andrews et al., 1996; Tsui et al., 2015). Bên cạnh đó, Erova và đồng tác giả (2013) đã biểu hiện trực tiếp gen caf1 trong nội bào của E. colivới việc sử dụng vector biểu hiện pET-20b(+) (Erova et al., 2013). Khi được biểu hiện ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)6 ở đầu cacboxyl, kháng nguyên F1 có thể được tạo ra ở trạng thái hòa tan (Erova et al., 2013). Trong nghiên cứu này, để tránh các vấn đề liên quan đến an toàn sinh học, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp nhân tạo gen caf1và đưa gen này vào vector pET- 22b(+) để biểu hiện kháng nguyên F1 ở dạng dung hợp với trình tự MBP (malto binding protein) và đuôi ái lực (His)10 ở đầu amin. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Chủng vi sinh vật Chủng E. coli TOP10 [F- mcrA Δ( mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG] (Thermosciencetific) được sử dụng để nhân dòng gen. Chủng E. coli BL21 (DE3) [F- ompT hsdSB (rBmB-) gal dcm (DE3)] (Thermosciencetific) được sử dụng để biểu hiện. 2.2 ...