Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây

I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gâySử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện vàxác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn eucalyptusobliqua L. HerI. ĐẶT VẤN ĐỀBạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania(Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E.obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng,trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuynhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đànsống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thànhphẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu,mất trọng lượng và độ bền. Xác định được nấm bệnh và cácđặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quảnlý. Có rất nhiều loài nấm không thể nuôi cấy trong điềukiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởivậy một số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánhchính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật. Bên cạnhđó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loàinấm gây mục gỗ chủ yếu, có thể phân lập được nhưng hệsợi lại không sinh ra bào tử hữu tính, đó là đặc điểm chínhđể xác định bằng phương pháp hình thái (Nobles 1948). Đãcó nhiều phương pháp được sử dụng để xác định nấm gâybệnh mục gỗ, như phân lập sợi nấm và xác định bằng hìnhthái sợi, nhuộm màu hóa học, cộng hưởng phân tử từ,phương pháp huyết thanh (hay phương pháp ELISA)(Jasalavich 2000). Bên cạnh đó, phương pháp phân tử PCR(Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuyếchđại các phân đoạn điển hình của DNA, ưu điểm của phươngpháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và phát hiện nấmbệnh ở giai đoạn rất sớm mà một số phương pháp trênkhông thể áp dụng. Phát hiện nấm bệnh bởi phương phápPCR và xác định nấm bệnh bằng phương pháp xác địnhtrình tự chuỗi trực tiếp từ các mẫu mô thực vật sẽ tránhđược các bước khó khăn trong phân lập và duy trì sợi nấmtinh khiết trên môi trường nhân tạo. Vùng sao chép nội bộITS (internal transcribed spacer) của ri-bô-xôm DNA làvùng phù hợp cho sự phân biệt các loài nấm (Mitchell et al.1995). Bài viết này trình bày kết quả nghiên cứu về phươngpháp sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện và xácđịnh nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bangTasmania.II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Nội dungPhát hiện nấm trong mẫu gỗ mục bằng kỹ thuật DNA.- Giám định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đànE. obliqua bằng kỹ thuật DNA.2. Vật liệuĐề tài sử dụng 26 mẫu gỗ mục được lấy mẫu từ các khúcgỗ mục ở giai đoạn trung bình của rừng bạch đàn E.obliqua tại Tasmania để xác định nấm mục gỗ bằngphương pháp phân tử và được thực hiện tại Phòng thínghiệm Sinh học phân tử, khoa Khoa học Nông nghiệp,trường Đại học Tasmania, Australia.3. Phương phápTách DNA: Lấy phoi gỗ mục được thực hiện theo phươngpháp của Jasalavich và đồng tác giả (2000) bằng cách sửdụng khoan sách tay. Phương pháp khử trùng bề mặt vàthay thế mũi khoan trong mỗi lần khoan được áp dụng đểtránh sự lấy nhiễm DNA giữa các mẫu gỗ. Tách DNA củacác loài nấm mục gỗ sử dụng phương pháp glassmilk củaGlen và đồng tác giả (2002). Cho một lượng nhỏ phoi gỗđến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vậtliệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơlỏng. Thêm vào đó khoảng 300-500 µl chất tách chiết DNA(Reader & Broda 1985). Ống eppendorf được ủ trong bểnước ở nhiệt độ 65oC trong 60 phút. Sau đó được ly tâmvới tốc độ 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Khoảng 200 µldịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong cóchứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 7 µl glassmilk.Hỗn hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút đểDNA gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm với tốc độ14,000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạchbằng dung dịch đệm và cồn. Sau đó hỗn hợp được ly tâm,tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tantrong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mMEDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 45oC trong vòng 5phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14,000 vòng/phút trong2 phút, phần hỗn hợp chứa DNA được chuyển sang ốngeppendorf mới, bảo quản ở 4oC.Khuyếch đại PCR: Vùng ITS 1 và 2 được khuyếch đại từDNA vừa thu trên bằng cặp mồi được thiết kế điển hìnhcho nấm ITS1-F (Gardes và Bruns 1993) và ITS4 (White etal. 1990). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl DNA được sửdụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1xpolymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl2, 0.2mM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH+polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA(Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số khuyếchđại PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi DNA ở 95oCtrong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi DNA ở 94oCtrong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 30 giây, kéo dài ở72oC trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài đượcthực hiện ở 72oC trong 7 phút. Phản ứng được thực hiệntrên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler.Điện ly: các sản phẩm PCR được điện ly trên bản gel (2,5%ag ...