Tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa Peptid kháng khuẩn tương tự Crustin ở Tôm sú ( penaeus monodon)

Peptid kháng khuẩn (Antimicrobial peptide - AMP) được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm. AMP cung cấp một lựa chọn tốt để phòng và trị các bệnh vi khuẩn truyền nhiễm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin (Crustin - like antimicroial peptide). Gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có chiều dài 426 bp, mã hóa cho 141 amino acid.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa Peptid kháng khuẩn tương tự Crustin ở Tôm sú ( penaeus monodon) Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 97(09): 87 - 92 TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ cDNA MÃ HÓA PEPTID KHÁNG KHUẨN TƯƠNG TỰ CRUSTIN Ở TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Hoàng Thị Thu Yến1*, Kim Thị Phương Oanh2, Phạm Anh Tuấn3, Nông Văn Hải2 1 Đại học Thái Nguyên Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3 Tổng Cục Thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Việt Nam 2 TÓM TẮT Peptid kháng khuẩn (Antimicrobial peptide - AMP) được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm. AMP cung cấp một lựa chọn tốt để phòng và trị các bệnh vi khuẩn truyền nhiễm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và xác định trình tự cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin (Crustin - like antimicroial peptide). Gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin có chiều dài 426 bp, mã hóa cho 141 amino acid. Kết quả so sánh trình tự nucleotid của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin ở tôm sú cho thấy không có sự sai khác so với trình tự đã công bố có mã số EF654659. Tuy nhiên, chúng tôi thấy có 5 vị trí sai khác nucleotid so với trình tự công bố với mã số FJ539178: 91 G → C; 291 T → A; 311 G → A; 338 C → A và 342 C → A, sự sai khác trình tự nucleotid này dẫn đến sự sai khác trình tự amino acid ở 5 vị trí: 35 V → L; 108 D → E; 112V → I; 124 T → N; 125 D → E. Điểm đáng lưu ý là trình tự nucleotid của gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin này không có đoạn trình tự từ 128-142 (TTCCTGGAGTTGGAG). Trình tự gen mã hóa peptid kháng khuẩn tương tự crustin phân lập từ tôm sú Việt Nam được đăng ký trên GenBank với mã số HQ662560. Đoạn cDNA mã hóa peptid kháng khuẩn mà chúng tôi phân lập được là nguyên liệu tốt phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm làm sáng tỏ chức năng của peptid kháng khuẩn này. Từ khóa: Tôm sú, Penaeus monodon, miễn dịch, crustin, peptid kháng khuẩn. MỞ ĐẦU* Peptid kháng khuẩn (AMPs) là một đoạn peptid hoặc protein nhỏ có độ dài phân tử thấp khoảng 15-100 amino acid, chúng khác nhau về trình tự và cấu trúc. Các AMP được tìm thấy ở hầu hết các sinh vật sống, có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên và thực hiện chức năng như là hàng rào đầu tiên chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm [3], [5]. Hiện nay, để xử lý tác nhân gây bệnh là vi khuẩn ở tôm, thuốc kháng sinh và hóa chất là phương pháp chính được sử dụng. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là chi phí mua thuốc lớn, tồn dư kháng sinh có thể đe dọa đến sức khỏe cộng đồng, ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời xuất hiện các mầm bệnh kháng thuốc và chúng có thể lây nhiễm cho con người [9]. * Tel: 0912. 896. 298; Email: yenhtt79@gmail.com Các AMP ở tôm được tổng hợp đầu tiên ở tế bào máu và giải phóng để đáp ứng lại sự lây nhiễm. Mô hình biểu hiện khác nhau của các AMP đã được đánh giá kết hợp với sự kích thích của nhiều nguồn bệnh. AMP có 3 họ peptid đại diện chính là: Penaeidin, crustin và yếu tố kháng khuẩn (ALF - antilipopolisaccharid factor). Phân tích trình tự nucleotid và amino acid đã phát hiện mỗi họ AMP của tôm có sự đa dạng về trình tự và có nhiều loại isoform, nhóm nhỏ. Hoạt tính sinh học của các AMP ở mỗi họ của tôm cũng được mô tả trong in vitro và in vivo khi nghiên cứu sử dụng các protein và peptid tái tổ hợp của chúng [9]. Ngoài ra, AMP khác được tìm thấy ở tôm có nguồn gốc từ hemocyanin, đoạn trình tự đầu C có hoạt tính kháng nấm. Tuy nhiên, cơ chế mà hemocyanin được phân tách và hoạt hóa vẫn chưa rõ ràng [4]. 87 Hoàng Thị Thu Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Crustin là các peptid kháng khuẩn giàu cystein chứa một vùng WAP (whey acidic protein) ở đầu C [7], vùng WAP có chứa 50 gốc amino acid với 8 gốc cystein ở các vị trí xác định, chúng hình thành 4 liên kết disulfid [6]. Hiện có khoảng hơn 50 trình tự crustin đã được phân lập từ các loài giáp xác như tôm, cua… Crustin có hoạt tính kháng các loại vi khuẩn Gram (-) [7], [9]. Ở họ tôm penaeid, các crustin đã được phát hiện ở nhiều loài tôm. Smith và đtg (2008) đã xếp họ crustin thành 3 loại: I, II và III trên cơ sở sự khác biệt trong tổ chức vùng giữa trình tự tín hiệu và vùng WAP (Whey acidic protein). Theo sự phân loại này, hầu hết các crustin thuộc loại II và một số ít thuộc loại III. So sánh trình tự amino acid loại II phát hiện hai nhóm nhỏ là: crustin II và peptid kháng khuẩn tương tự crustin (crustin-like antimicrobial peptide), 2 loại này khác nhau ở amino acid suy diễn của peptid tín hiệu và đoạn cystein ở giữa vùng giàu cystein và vùng WAP [6]. Crustin loại III được gọi là protein vùng WAP đơn (single WAP domain - SWDs) không chứa vùng giàu cystein và glycin nhưng có vùng giàu prolin-arginin giữa trình tự tín hiệu và vùng WAP [7]. Ở tôm sú, có 5 isoform của crustin loại III với chiều dài rất khác nhau đã được phân lập và đây là peptid ...