Tạo plasmid RNAi tương ứng với gen M2L1 (ID 149958) thuộc họ gen myosin II ở nấm Mucor circinelloides

Mucormycosis là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi nhiều loài nấm thuộc bộ Mucorales. Nấm Mucor circinelloides là một loài vi nấm mô hình được sử dụng cho nghiên cứu về bệnh mucormycosis. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định các đặc điểm kiểu hình của nấm gây bệnh, nhất là tính lưỡng hình, có thể sử dụng làm chỉ thị để đánh giá khả năng gây bệnh của chúng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Tạo plasmid RNAi tương ứng với gen M2L1 (ID 149958) thuộc họ gen myosin II ở nấm Mucor circinelloides BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.000111 TẠO PLASMID RNAi TƯƠNG ỨNG VỚI GEN m2l1 (ID 149958) THUỘC HỌ GEN MYOSIN II Ở NẤM Mucor circinelloides Lê Ngọc Mai1, Nguyễn Thu Hà1, Nguyễn Văn Hân1,2, Nguyễn Duy Khánh1,3, Triệu Anh Trung1* Tóm tắt: Mucormycosis là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi nhiều loài nấm thuộc bộ Mucorales. Nấm Mucor circinelloides là một loài vi nấm mô hình được sử dụng cho nghiên cứu về bệnh mucormycosis. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định các đặc điểm kiểu hình của nấm gây bệnh, nhất là tính lưỡng hình, có thể sử dụng làm chỉ thị để đánh giá khả năng gây bệnh của chúng. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh gen mã hóa protein myosin V (ID 51513) liên quan đến kiểu hình và khả năng gây bệnh của nấm Mucor. Từ đó chúng tôi đã phát hiện ra ba họ gen myosin I, II và V trong hệ gen của loài nấm này, các protein trong mỗi họ gen đều có các đặc điểm cấu trúc đặc trưng tương ứng. Để sàng lọc các gen ứng viên thuộc họ myosin II có khả năng liên quan đến kiểu hình và cơ chế gây bệnh của nấm Mucor, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RNAi. Một đoạn gen của gen đích m2l1 (ID 149958) đã được phân lập và nhân dòng vào vector plasmid pMAT1812 có chứa hai promoter ngược chiều nhau để tạo plasmid RNAi. Plasmid tái tổ hợp này đã được kiểm tra bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn và kỹ thuật giải trình tự gen. Từ khóa: Mucor circinelloides, mucormycosis, myosin, RNAi. 1. MỞ ĐẦU Mucormycosis là một loại bệnh nhiễm trùng cơ hội ở người được gây ra bởi nấm thuộc bộ Mucorales, đây là một loại bệnh hiếm gặp nhưng khả năng tử vong cao, đặc biệt đối với những người bị suy giảm miễn dịch, HIV/ AIDS, tiểu đường hay cấy ghép nội tạng (Brown, 2005; Challa, 2019). Mucormycosis là một trong những bệnh nấm sâu khó điều trị, do bệnh đáp ứng kém với các loại thuốc trị nấm thông thường và chúng ta chưa có các liệu pháp điều trị hiệu quả. Nguyên nhân chủ yếu là do những hiểu biết về cơ chế gây bệnh còn hạn chế. Do đó, những nghiên cứu về cơ chế phân tử của bệnh có ý nghĩa trong việc tạo cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tạo các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn (Lopez-Fernandez et al., 2018). Nấm Mucor circinelloides là một trong số các tác nhân gây bệnh mucormycosis có thể được tìm thấy ngay trong đất cũng như trong rác hữu cơ. Loài nấm này đã và đang được sử dụng làm mô hình cho nhiều nghiên cứu khác nhau, bao gồm cơ chế phân tử của RNAi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng (Nicolás et al., 2003), sinh tổng hợp carotene (Torres- Martínez et al., 2012), sinh tổng hợp lipid (Andrade et al., 2014) và mucormycosis (Lee et 1Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2Trường THPT Tuệ Tĩnh, Cẩm Giàng, Hải Dương 3Trường THPT chuyên Hùng Vương, Việt Trì, Phú Thọ *Email: trungta@hnue.edu.vn 896 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM al., 2013). Đặc tính này của nấm M. circinelloides có được là do nó có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, dễ thao tác, hệ gen của nấm đã được giải mã và công bố và nó có thể áp dụng được nhiều kĩ thuật sinh học phân tử khác nhau, đặc biệt là kỹ thuật biến nạp gen và các thao tác trên hệ gen. Tính lưỡng hình của nấm là một quá trình trong đó chúng có thể phát triển thành dạng sợi nấm hoặc giống như nấm men, tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Sự chuyển tiếp nấm men-dạng sợi này góp phần vào độc lực của nấm. M. circinelloides cũng là một loại nấm lưỡng hình phát triển thành hệ sợi điển hình trong điều kiện hiếu khí và là dạng nấm men trong điều kiện yếm khí/CO2 cao. Sự chuyển đổi giữa hai dạng ở loài nấm này đã được chứng minh là có liên quan đến độc lực của nó, vì pha nấm men không gây bệnh (Lee et al., 2013). Ngoài ra, kích thước của bào tử cũng liên quan đến độc lực của M. circinelloides, trong đó chỉ có các chủng tạo ra bào tử đa nhân lớn mới có khả năng gây bệnh (Li et al., 2011). Những kết quả này cho thấy rằng tính lưỡng hình và các đặc điểm kiểu hình khác có thể được sử dụng làm chỉ thị để đánh giá sơ bộ về độc lực của loài nấm này. Ở nấm M. circinelloides, một protein thuộc họ Myosin V, Mcmyo5 (ID 51513) đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của loài nấm này (Trieu et al., 2017). Từ đó chúng tôi đã mở rộng tìm kiếm các protein có trình tự axitt amino tương tự Mcmyo5 và đã phát hiện ra có 3 họ gen Myosin I, Myosin II và Myosin V trong hệ gen của loài nấm này. Các họ protein này có các đặc điểm cấu trúc đặc trưng tương tự như họ protein tương ứng ở các loài khác. Những thông tin này gợi ý rằng các họ protein nói trên cũng tham gia vào cơ chế gây bệnh của nấm Mucor. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu thực nghiệm nào chứng minh nhận định này. Họ protein Myosin II ở loài nấm M. circinelloides có hai gen ID 149958 và ID 136314, chúng tôi đặt tên lần lượt là m2l1 và m2l2. Trong bài báo này, chúng tôi tiến hành thiết kế và xây dựng plasmid RNAi tương ứng với gen m2l1 mã hóa protein ID 149958 thuộc họ Myosin II. Plasmid này sẽ được sử dụng để gây ức chế biểu hiện của gen tương ứng nhằm phục vụ cho nghiên cứu chức năng của gen. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Chủng nấm M. circinelloides R7B (leuA- pyrG+) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Di truyền học và Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Đại học Murcia, Tây Ban Nha. Tế bào khả biến của chủng vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để nhân dòng các plasmid tái tổ hợp. Plasmid pMAT1812 có kích thước 9,5 kb với 2 promoter ngược chiều nhau ở 2 phía của vùng MCS giúp phiên mã đoạn gen được nhân dòng tạo thành các đoạn dsRNA. Ngoài ra trên plasmid còn có một đoạn gen carB có kích thướ ...