Thí nghiệm công nghệ enzim

Cân 20-100 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dung dịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000 vòng/phút để được dung dịch enzym trong suốt. Nguyên tắc : Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt. Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym có khả năng phân giải 1mg...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm công nghệ enzimThí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch BÀI 1 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO PHƯƠNG PHÁP HEINXEL1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm mốc và từ malt. Cân 20-100 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặcmalt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dungdịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000vòng/phút để được dung dịch enzym trong suốt.1.2. Nguyên tắc : Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độgiảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt. Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym có khả năng phân giải 1mg tinhbột sau 30 phút ở 30 0C.1.3. Cách tiến hành và tính kết quả : Cho vào ống nghiệm 1mg dung dịch tinh bột 1%, 1 mg dung dịch NaCl0,1% và 2 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6.0, lắc đều, giữ ở 30 0Ctrong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 30 0C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dungdịch enzym đã đạt đến 30 0C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở 30 0C đúng 30 phút lấyống nghiệm ra khỏi tủ ấm, cho ngay vào 5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20% để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc. Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự nhưtrên nhưng cho dung dịch axít sunfosalisilic vào trước rồi mới cho dung dịchenzym. Lấy 1ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vàoống nghiệm, thêm 9 ml dung dịch iốt pha loãng 150 lần. So màu ở bước sóng560 nm. Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đốichiếu với đường cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải. Hoá chất sử dụng : - Dung dịch NaCl 0,1% - Dung dịch axít sunfosalisilic 20% - Dung dịch iốt : hoà tan 1g iốt vào 5ml dung dịch có chứa 2 g KI, thêm nước cất vào đến 300ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 150 lần. - Dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0 62Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch - Dung dich tinh bột 1% trong dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0. Cân 1g tinh bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml dung dịch đệm đang sôi, để nguội, thêm dung dich đệm vào cho đến 100ml. Để bảo quản dung dịch tinh bột có thể thêm 1g benzoat natri. - Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1% : Cân 1 g tinh bột trộn với 10 ml nước cất, thêm 80 ml nước cất đang sôi, khuấy đều và nếu cần tiếp tục đun để nhận được dung dịch trong suốt, để nguội cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước cất đến vạch mức. Từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mgtinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 ml dung dịch tinh bột 1% và thêmnước cất vào cho đến 10 ml. Lập đồ thị tiêu chuẩn : Lấy 0,1 ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị nhưtrên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1 %; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nướccất; 0,5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20%, lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iốtđã pha loãng 150 lần, so màu ở bước sóng 560 nm. Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trêntrục hoành ghi số mg tinh bột, trục tung ghi số đọc được trên máy tương ứng. 63Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch BÀI 2 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLAZA DỰA VÀO LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TẠO THÀNH.2.1. Chiết tách dịch enzym. Tiến hành giống như ở phần 1.1 của bài 1 ở trên.2.2. Xác định hoạt độ amylaza theo phương pháp Nelson. - Nguyên tắc : Sau khi cho enzym thuỷ phân tinh bột ở những điều kiệnxác định, đun hỗn hợp phản ứng với dung dịch đồng (II), tạo thành kết tủaCu2O. Hoà tan kết tủa trong thuốc thử arseno-molypden sẽ nhận được màuxanh da trời. So màu ở bước sóng 660nm, đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn đểtính lượng đường. - Đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym mà trong 30 phút ở 300C có thểphân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương ứng với 1 micromolglucoza.2.3. Cách tiến hành và tính kết quả : - Chuẩn bị 2 ống nghiệm khô, sạch, cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịchenzym có độ pha loãng thích hợp. Cho vào ống thứ 1 (ống kiểm tra) 1 molthuốc thử 5 và 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 %. Ống thứ 2 (ống thí nghiệm) đặtvào tủ ấm 30 0C trong 10-15 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 % (đãđạt 30 0C) lắc đều, giữ đúng 30 phút ở 30 0C. Sau đó cho 1 ml thuốc thử 5 lắcđều. Đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thuỷ đang sôi trong 20 phút rồi lấy ralàm nguội dưới vòi nước chảy. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử arseno-molypden, lắc liên tục cho đến khi ngừng tạo thành bọt khí CO2 và hoà tanhoàn toàn kết tủa Cu2O. Thêm nước cất đến 10 ml. Lắc đều, so màu ở bướcsóng 660 nm đối với mẫu trắng. Mẫu trắng : Cho 1 ml nước cất, 1 ml thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trongnồi cách thuỷ đang sôi, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden vàtiếp tục làm như ...