Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 1

Mở đầuI. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu) 1. Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ) + Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion 2. Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L) 3. Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 1 150http://www.ebook.edu.vnBài 1 Mở đầuI. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thựcvật(ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu)1. Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ) + Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion2. Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L)3. Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân kỹ thuật 10-2g + Bếp điện - Microwave + Tủ lạnh 100-200 L - Tủ lạnh sâu (-20 ÷ -80oC)4. Phòng cấy vô trùng + Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench) + Quạt thông gió + Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m) - Thiết bị lọc không khí 151http://www.ebook.edu.vn5. Phòng ảnh - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu6. Phòng kính hiển vi + Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần). + Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máychụp ảnh kỹ thuật số. + Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần). - Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học. - Kính hiển vi huỳnh quang7. Phòng nuôi + Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗđể bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. + Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút) + Tủ ấm - Nồi phản ứng sinh học (bioreactor)8. Phòng sinh hóa + Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...) + Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide) + Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA vàprotein (Gene documentation system) + Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm - Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tếbào và mô nuôi cấy.II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bàothực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng. - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách. 152http://www.ebook.edu.vn - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.1. Bảo đảm điều kiện vô trùng1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường,muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn pháttriển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so vớicác tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bàotử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môitrường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn.Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không pháttriển và chết dần. Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), trong khi thí nghiệm vi sinhvật có thể kết thúc trong một vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùngtrong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc,điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vậttrong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rấtcao mới có hy vọng thành công được.1.2. Nguồn nhiễm tạp Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: - Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùngtuyệt đối. - Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bàotử nấm hoặc vi khuẩn. - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lênbề mặt môi trường.1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trườnga. Dụng cụ thủy tinh Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải làloại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tínhđể tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôicấy. 153http://www.ebook.edu.vn Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thôngthường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầukhi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạchbằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráonước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần được vôtrùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau khi nguội được lấy ra cấtvào chỗ ít bụi.b. Nút đậy Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thờinước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôicấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nh ...