Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 6

Nuôi cấy protoplastI. Mục đích và yêu cầuKỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe (1971) khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lập protoplast, đó là: - Cơ học (không dùng các enzyme) - Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời) Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng độ của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 6 181http://www.ebook.edu.vnBài 6 Nuôi cấy protoplastI. Mục đích và yêu cầu Kỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe(1971) khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có baphương thức phân lập protoplast, đó là: - Cơ học (không dùng các enzyme) - Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời) Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng độ của cácenzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có thànhcho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận củacây (lá, rễ, hạt phấn), mô sẹo, tế bào đơn... Protoplast thực vật có ba ứng dụng chính sau: - Chọn dòng tế bào biến dị soma. - Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật. - Biến nạp di truyền: đưa các cơ quan tử, virus và DNA ngoại laivào tế bào thực vật.II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ - Bình tam giác (100 mL), đĩa petri nhựa đã vô trùng (disposable) - Giấy thấm vô trùng - Forceps, kéo, dao mổ - Đĩa petri thủy tinh vô trùng - Giấy parafilm, giấy nhôm - Tube ly tâm loại 15 mL - Lưới lọc có đường kính lỗ lọc 65µm - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette2. Thiết bị - Nồi khử trùng 182http://www.ebook.edu.vn - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm (tốc độ 6000-10000 rpm), rotor cho tube 15 mL - Máy lắc - Buồng đếm - Kính hiển vi đảo ngược3. Hóa chất - Dung dịch enzyme tách protoplast - Môi trường phân lập (PI), môi trường nuôi cấy protoplast (PC) - Cồn 90% - Nước cất vô trùngIII. Phương pháp tiến hành1. Nguyên liệu thực vật Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu táchprotoplast. Sử dụng các lá được tách trong ngày.2. Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulase R10 0,5 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 % + Mannitol 13,0 % + pHmôi trường ~ 5,8 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại cóđường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm.3. Tiến hành 183http://www.ebook.edu.vn a. Ngày thứ nhất Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩapetri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 mLbổ sung 10 mL dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấyparafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp(khoảng 40 vòng/phút). b. Ngày thứ hai Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng(Φ = 65µm) đặt trong cốc loại 50 mL. Bổ sung thêm 3 mL dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốcchứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vàohỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. Bổ sung thêm 2 mL dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏilưới lọc (dùng forceps để giữ lưới lọc trong lúc rửa). Chuyển hỗn hợpprotoplast-enzyme (tổng cộng 15 mL) vào tube ly tâm loại 15 mL và lytâm 50×g trong 10 phút. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng10mL dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1mL dung dịch rửa lêntrên bề mặt dung dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn haidung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thànhtube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút.Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch (thể nổi). Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tubely tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 mL dung dịch rửavà ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên (cục tròn). Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 mL dung dịch rửa.(lần rửa này có thể bỏ qua nếu các “hạt” protoplast quá bé hay quá ít chỉvừa đủ dùng). Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trongkhoảng chừng 1 mL môi trường nuôi cấy protoplast (PC). Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượngmật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplastbằng cách pha loãng 50.000 tế bào/mL môi trường nuôi cấy protoplast vàchuyển sang một đĩa petri vô trùng. Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC. 184http://www.ebook.edu.vn c. Ngày thứ ba ...