Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 7

Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciensI. Mục đích và yêu cầuCác thực vật chuyển gen đã được tạo ra bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Có hai phương thức chính: - Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điện, vi tiêm, siêu âm, silicon carbide, thông qua ống phấn, điện di ... - Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vật): Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém hơn cả là chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 7 185http://www.ebook.edu.vnBài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciensI. Mục đích và yêu cầu Các thực vật chuyển gen đã được tạo ra bằng nhiều kỹ thuật khácnhau. Có hai phương thức chính: - Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điện, vi tiêm, siêu âm,silicon carbide, thông qua ống phấn, điện di ... - Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vật): Agrobacteriumtumefaciens. Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém hơn cả làchuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium. Agrobacteriumtumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm có trong đất, thường được sửdụng để tiến hành biến nạp di truyền trên đối tượng thực vật. Đoạn DNAmuốn chuyển vào một cây nào đó có thể được thao tác dễ dàng trên E. colivà sau đó chuyển trở lại vào Agrobacterium. Việc chuyển gen vào thực vậtqua Agrobacterium đã thực hiện thành công trên nhiều loại cây: thuốc lá,đậu tương, các cây họ đậu nhiệt đới, bông cải, khoai tây.II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất1. Dụng cụ - Bình tam giác (250 mL), ống nghiệm có nắp vặn - Giấy thấm vô trùng - Forceps, kéo, dao mổ - Que cấy vi sinh - Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng - Giấy parafilm - Giấy nhôm - Tube eppendorf (1,5-2 mL) - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette2. Thiết bị - Nồi khử trùng 186http://www.ebook.edu.vn - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 mL3. Hóa chất - Môi trường cơ bản MS - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB - Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và cefotaxim - Agar - MgSO4 10mM - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: NAA và BAP - Cồn 90% - Nước cất vô trùngIII. Phương pháp tiến hành1. Nguyên liệu - E. coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper plasmid) - E. coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+ insert DNA (genngoại lai mang tính trạng mong muốn) - Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404. - Cây thuốc lá in vitro.2. Chuẩn bị môi trường2.1. Môi trường LB - Bacto-tryptone 3g - Yeast-Extract 1,5 g - NaCl 3g - Nước cất đến đủ 300mL. 187http://www.ebook.edu.vn2.2. Môi trường LB đặc Môi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL.2.3. Môi trường LB-R Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin.2.4. Môi trường LB-K Môi trường LB bổ sung 50 µg/mL kanamycin.2.5. Môi trường LB-RK Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin và 50 µg/mLkanamycin.2.6. Môi trường MSO - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - pHmôi trường ~ 5,82.7. Môi trường nuôi cấy (MS 104) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - BAP 2 mg/mL - NAA 0,2 mg/mL - pHmôi trường ~ 5,82.8. Môi trường chọn lọc (MS SEL) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - BAP 2 mg/mL 188http://www.ebook.edu.vn - NAA 0,2 mg/mL - Kanamycin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pHmôi trường ~ 5,82.9. Môi trường tạo rễ (MSR) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - Kanamyin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pHmôi trường ~ 5,8 Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản trong điềukiện không có ánh sáng. Chất kháng sinh được bổ sung sau khi đã khửtrùng môi trường (để nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-60oC) ởđiều kiện vô trùng của laminar.3. Tiến hành3.1. Triparental mating (giao phối bộ ba) a. Nuôi cấy vi khuẩn Các môi trường LB lỏng được chuẩn bị trong các ống nghiệm cónắp vặn, khử trùng để tiến hành nuôi cấy các vi khuẩn. Các bước như sau: Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28oC,thời gian 48 giờ (nuôi trước khi tiến hành triparental mating 2 ngày). Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E. coli cómang vector pBI 121 + insert DNA trong môi trường LB-K (nuôi trướckhi tiến hành lai bộ ba 1 ngày). b. Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩn Các bước tiến hành: Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly tâm tốc độkhoảng 10.000 rpm, trong 5 giây. Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để trộn (đểloại bỏ chất kháng sinh). 189http://www.ebook.edu.vn Lập lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 µl môi trường ...