Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225

Bài viết Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225 đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giống lúa chủ lực TBR225.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 9: 1220-1229 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2022, 20(9): 1220-1229 www.vnua.edu.vn Ngô Thị Vân Anh1, Nguyễn Anh Minh2, Phạm Thu Hằng2, Phạm Phương Ngọc2, Lê Quỳnh Mai3, Phạm Xuân Hội2, Nguyễn Duy Phương2* 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Viện Di truyền Nông nghiệp 3 Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: phuongnd.bio@gmail.com Ngày nhận bài: 06.08.2022 Ngày chấp nhận đăng: 27.09.2022 TÓM TẮT Cadmium (Cd) có độc tính rất cao đối với hầu hết các sinh vật sống, bao gồm cả con người. Lúa gạo chứa hàmlượng Cd vượt ngưỡng (0,2 mg/kg - QCVN 8- 2:2011/BYT) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc Cd.OsNRAMP5 thuộc họ NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) đã được xác định có liên quan tới quátrình vận chuyển nhiều kim loại như sắt (Fe), kẽm (Zn), đồng (Cu), mangan (Mn) và Cd ở lúa. Để phục vụ nghiên cứuchức năng OsNRAMP5, chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (ClusteredRegular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giốnglúa chủ lực TBR225. Bằng phương pháp xử lý nhân tạo trong dung dịch trồng thủy sinh có bổ sung Cd, OsNRAMP5 đãđược chứng minh tăng cường biểu hiện ở mô rễ lúa TBR225. Một phần trình tự chứa ExonI của OsNRAMP5 dài 0,29kbđã được phân lập để phục vụ thiết kế sgRNA (single guide RNA) cho hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5. Cấutrúc biểu hiện sgRNA mang hai trình tự crRNA (CRISPR RNA) nhận biết ExonI OsNRAMP5 đã được ghép nối vào vectornhị thể pCas9. Vector tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự Nu. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho cảitiến chất lượng giống lúa chủ lực TBR225 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen. Từ khóa: Bất hoạt gen, Cadmium, CRISPR/Cas9, OsNRAMP5, TBR225. Designing CRISPR/CAS9 System for Knocking out OsNRAMP5 Related to Cadmium Accumulation in Rice Variety TBR225 ABSTRACT Cadmium (Cd) is highly toxic to most living organisms, including humans. Rice with excessive Cd (> 0,2 mg/kg -QCVN 8-2:2011/BYT) is one of the leading causes of Cd poisoning, threatening human health. Several genesbelonging to the NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) family are related to metalaccumulation in plants; in which OsNRAMP5 has been identified to be involved in the transport of various metalssuch as iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), manganese) Mn and Cd in rice. In order to identify the function ofOsNRAMP5 in elite rice variety TBR225, we evaluated the expression of the targeted gene and designed Clusteredregular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 (CRISPR/Cas9) system for editing TBR225OsNRAMP5. The increase of OsNRAMP5 expression was observed in the root tissues of TBR225 rice plant in theCd-treatment experiment using hydroponic culture. A sequence containing the ExonI region of OsNRAMP5 with asize of 0.29kb was isolated from the total DNA of TBR225 to design single guide RNAs (sgRNA) for OsNRAMP5-editing CRISPR/Cas9 system. The sgRNA expression construct carrying two CRISPR RNA (crRNA) sequencesrecognizing two different sites on the ExonI of OsNRAMP5 was ligated into the binary vector pCas9. The recombinantvector was validated by PCR and sequencing analysis. The results serve as basis for the improvement of TBR225rice variety with high quality by using genome editing technology. Keywords: Cadmium, CRISPR/Cas9, Knocking out gene, OsNRAMP5, TBR225.1220 Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng,Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương - -  1221Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225 µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µl µ Mục đích Kích thước Tên Trình tự Gen đích thí nghiệm (bp) NRAMP5-F GGTGTGGCTTGAGAGTTCGT OsNRAMP5 [12] Phân lập 286 NRAMP5-TBR NRAMP5-R CATGGTGACAGTGGAGTGCT NRAMP5-RT-F CAGC ...