Thiết lập và tối ưu hoá quy trình realtime PCR phát hiện Decapod Iridescent virus 1 gây bệnh trên tôm

Nghiên cứu được thực hiện để thiết lập, tối ưu hoá quy trình realtime PCR phục vụ chẩn đoán và kiểm soát bệnh DIV1 trên tôm. Mẫu plasmid chứa hai đoạn gen đích của DIV1 là MCP và ATPase được sử dụng để thiết lập và tối ưu hoá quy trình với lượng mồi dò probe ở các nồng độ 0,1; 0,15 và 0,2µM.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Thiết lập và tối ưu hoá quy trình realtime PCR phát hiện Decapod Iridescent virus 1 gây bệnh trên tômVietnam J. Agri. Sci. 2024, Vol. 22, No. 2: 215-225 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2024, 22(2): 215-225 www.vnua.edu.vn THIẾT LẬP VÀ TỐI ƯU HOÁ QUY TRÌNH REALTIME PCR PHÁT HIỆN DECAPOD IRIDESCENT VIRUS 1 GÂY BỆNH TRÊN TÔM Nguyễn Thị Huyền1, Nguyễn Thị Kim Oanh1, Vũ Đăng Thắng1, Nguyễn Đăng Hồng Ngọc1, Nguyễn Thanh Loan1, Âu Xuân Khoa1, Vũ Thị Lan Hương1, Nguyễn Thị Thúy Mận1, Trương Đình Hoài2* Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương 1 2 Khoa Thuỷ sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 28.07.2023 Ngày chấp nhận đăng: 26.01.2024 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện để thiết lập, tối ưu hoá quy trình realtime PCR phục vụ chẩn đoán và kiểm soátbệnh DIV1 trên tôm. Mẫu plasmid chứa hai đoạn gen đích của DIV1 là MCP và ATPase được sử dụng để thiết lập vàtối ưu hoá quy trình với lượng mồi dò probe ở các nồng độ 0,1; 0,15 và 0,2µM. Độ nhạy, hiệu suất, mức độ đặc hiệu,mức độ ổn định giữa các lần xét nghiệm và kết quả đối sánh liên phòng thí nghiệm được chuẩn hoá trong và ngoàinước được sử dụng để đánh giá hiệu quả và giá trị sử dụng của quy trình. Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trìnhrealtime PCR ở nồng độ mồi dò 0,2µM cho thấy khả năng phát hiện tối ưu nhất. Giới hạn phát hiện của phản ứng lầnlượt là 13,6 và 14,3 bản sao plasmid/phản ứng, hiệu suất lần lượt là 98,9% và 92,6%. Phản ứng có độ đặc hiệu cao(không có phản ứng với các mẫu tôm dương tính với WSSV, IHHNV, AHPND, EHP) và ổn định (CV < 15%). Kết quảnghiên cứu cho thấy hai quy trình realtime PCR sử dụng plasmid chứa gen MCP và ATPase đã được thiết lập và tốiưu hoá trong nghiên cứu này đảm bảo độ tin cậy và có thể ứng dụng để tầm soát và kiểm soát bệnh DIV1 cho cácphòng thí nghiệm tại Việt Nam. Từ khoá: Realtime PCR, thiết lập, tối ưu, plasmid, DIV1. Establishment and Optimization of Realtime PCR Assays for Detecting Disease in Shrimp Caused by Decapod Iridescent Virus 1 ABSTRACT The study was conducted to establish, optimize and validate the real-time PCR assay for the detection ofDecapod iridescent virus 1 (DIV1) and control of this disease in shrimp. The plasmid samples containing two targetgenes MCP and ATPase of DIV1 were used to establish and optimize the procedure using different probeconcentrations 0.1, 0.15 and 0.2µM. The sensitivity, performance, specificity, inter-assay stability, and interlaboratorymatching results from nationally and internationally standardized laboratories were used to evaluate the efficacy andvalidity of these real-time PCR assays. The results of real-time PCR using plasmids containing target MCP andATPase genes at a probe concentration of 0.2µM revealed the best detection ability. The reaction detection limitswere 13.6 and 14.3 plasmid copies/reaction with the efficiency at 98.9% and 92.6%, respectively. The assaysexhibited high specificity (no reaction to all shrimp-positive samples for WSSV, IHHNV, AHPND, and EHP) and highstability (CV < 15%). The study results showed that two real-time PCR assays using plasmids carrying target MCPand ATPase genes of DIV1 established in this study could ensure reliability and applicability to laboratories forscreening and controlling DIV1 disease in Vietnam. Keywords: Real-time PCR, procedure establishment, optimization, MCP and ATPase genes, plasmids, DIV1. phát hiện læn đæu tiên vào đæu nëm 2014 trên1. ĐẶT VẤN ĐỀ tôm càng đỏ (Cherax quadricarinatus) täi tînh Decapod Iridescent Virus 1 (DIV1) đþĉc Phúc Kiến (Fujian) cûa Trung Quốc (Xu & cs., 215Thiết lập và tối ưu hoá quy trình realtime PCR phát hiện Decapod Iridescent Virus 1 gây bệnh trên tôm2016). Sau đó DIV1 đþĉc xác định là nguyên thăc hiện các biện pháp tæm soát, kiểm soátnhân gây chết hàng loät tôm chân tríng ć một bệnh, đðc biệt ć tôm giống, tôm bố mẹ và sânsố tînh ven biển cûa Trung Quốc. Kết quâ phèm nhêp khèu tÿ các ...